黄酒中尿素的吸附去除技术研究

郭双丽，王栋，徐岩

(江南大学，工业生物技术教育部重点实验室，食品安全与营养协同创新中心，江南大学生物工程学院酿造微生物及应用酶学研究室，江苏 无锡，214122)



黄酒中尿素的吸附去除技术研究

郭双丽，王栋*，徐岩

(江南大学，工业生物技术教育部重点实验室，食品安全与营养协同创新中心，江南大学生物工程学院酿造微生物及应用酶学研究室，江苏 无锡，214122)

黄酒中的氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate，EC)主要是由尿素与乙醇反应产生的，降低尿素的含量对氨基甲酸乙酯的控制具有极其重要的意义。通过筛选获得有效吸附黄酒中尿素的树脂材料，在较优条件下：树脂添加量10%(体积分数)，温度40 ℃，吸附时间24 h，不同尿素水平黄酒单次吸附后的尿素去除率在32%～49%。对于尿素浓度较高(大于15 mg/L)的黄酒经多次吸附处理后，尿素浓度均能降至4 mg/L以下，且吸附后黄酒的基本理化指标和主要风味成分没有显著变化。该技术在不改变黄酒酿造微生物和酿造工艺的情况下，为安全、有效地减除黄酒中的尿素提供了新的途径。

黄酒；尿素；树脂；吸附

氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，简称EC)存在于许多发酵食品和酒饮料中[1-2]。2007年，国际癌症研究机构(IARC)将EC定为2A类致癌物质——“很可能对人类有致癌作用”[3]，其对健康的影响近来受到越来越多的重视。黄酒是中国特有的传统酒精饮料，研究表明，黄酒中含有较高的EC浓度[4]，控制EC的含量对于提高黄酒的品质和行业的发展至关重要。

黄酒中的氨基甲酸乙酯主要是在煎酒和贮存过程中产生的，绝大部分由尿素形成[5]，因此，控制黄酒中EC的含量关键是要降低其前体尿素的浓度。不同黄酒中尿素含量差异较大，常见市售黄酒中尿素的浓度范围为7～35 mg/L[5]。关于尿素的控制指标，葡萄酒相关研究表明，为防止贮存过程中EC继续增加，尿素的浓度应降至2 mg/L左右[6]。黄酒中尿素的浓度普遍高于该标准，目前尚没有明确的控制指标。

黄酒中高浓度的尿素主要是由酵母代谢产生的[7]。为降低尿素含量，国内外根据尿素的来源主要采用添加酸性脲酶、酵母基因改造等方法[8-9]。虽然这些方法对尿素的去除根据文献报道具有很好的效果，但也存在一定的问题，如：目前国内酸性脲酶尚未实现工业化生产，添加酸性脲酶增加了黄酒的经济成本，且尿素浓度低于10 mg/L时，酶的催化效率变得极低[10]；酵母的基因改造可能改变了黄酒的风味和口感等[7, 11]。医药行业有研究表明，尿素分子的-NH2和—CO基团可以与重金属的d轨道配位，利用重金属螯合材料可以有效降低高浓度尿素的含量[12-13]。林文浩等人采用自制的黄酒助剂吸附处理黄酒中的EC，结果表明该助剂对尿素也有一定的去除效果[14]。此外，王翼玮、刘俊等人采用特异性树脂吸附处理黄酒中的EC也取得较好的效果[15-16]。这些研究为我们开发新的黄酒中尿素的去除方法提供了一定的借鉴。

本研究根据黄酒中的尿素可能与重金属材料的配位特性，以及与EC分子的结构相似性，对重金属螯合材料和树脂材料进行筛选，获得吸附去除黄酒中尿素的性能良好的吸附材料。在较优的条件下吸附处理黄酒中尿素，对尿素浓度较高的黄酒采取多次吸附处理方式，显著降低尿素水平，以期达到控制EC形成的目的。并对吸附前后黄酒的基本理化指标和风味物质变化进行分析。本研究为黄酒中尿素浓度的控制提供了新途径，对EC浓度的控制具有重要的意义。

1　材料和方法

1.1实验试剂与仪器

1.1.1黄酒酒样

市售黄酒(清爽型或半干型，尿素质量浓度范围5.0～40.0 mg/L，酒精度范围10.0%～16.8%vol)。

1.1.2吸附材料

吸附材料由浙江争光实业股份有限公司和江苏苏青水处理工程集团有限公司提供，均为食品级，其材料类型和性质如表1所示。

表1　吸附材料性质

注：a数据来源于相关产品的使用说明。

1.1.3实验试剂

乙腈、甲醇(上海安谱)、无水乙醇、1-丙醇(上海百灵威)，色谱纯，9-羟基吨(纯度≥99.9%)、尿素(纯度>99.9%)，色谱纯，上海Sigma公司，氯化钠、无水乙酸钠、浓盐酸(36.7%)、3,5-二硝基水杨酸(DNS)、三氯乙酸(TCA)、乙酸、甲醛、氢氧化钠、浓硫酸，分析纯，上海国药集团。

1.1.4实验仪器

安捷伦1200、示差折光检测器(RID)、Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm × 7.8 mm，9 μm，美国Agilent公司)、Wasers 2475荧光检测器、Waters 2695高效液相色谱仪(美国沃特斯公司)、C18色谱柱(Zorbax SB-Aq，250 mm × 4.6 mm, 5 μm，美国Agilent公司)、超纯水系统(美国Millipore公司)、摇床(恒温调控回转式，上海杜科自动化设备有限公司)、GC-MS(Agilent 6890N GC-5973 MS气质联用仪，美国安捷伦公司)、固相微萃取自动进样器(德国Gerstel公司)、DB-FFAP毛细管色谱柱(60 m × 0.25 mm × 0.25 μm，美国Agilent公司)、pH计(Mettler Toledo公司)、万分天平(Mettler Toledo公司)。

1.2实验方法

1.2.1树脂的预处理

50 mL湿体积的吸附材料用去离子水清洗至出水无混浊、无杂质，以100 mL 3%的NaOH和7%的NaCl溶液浸泡8 h后用去离子水洗至中性，再以100 mL 3%的HCl溶液浸泡8 h，去离子水洗至pH=4.0，90%乙醇浸泡4 h后水洗至无醇味备用。

1.2.2吸附材料的筛选

取10 mL湿体积材料至250 mL 磨口三角瓶中，并添加100 mL黄酒，摇床温度30 ℃、转速150 r/min，振荡处理24 h。取上清液测定其尿素浓度，以吸附前后尿素浓度的含量计算尿素去除率。同时处理后的酒样与原酒样比较，从颜色和香气上作初步分析。

1.2.3尿素浓度的测定

参照文献方法[17]，配制尿素标准液、1.5 mol/L盐酸溶液、0.02 mol/L 9-羟基吨溶液和乙酸钠溶液。

样品前处理：500 μL 酒样用色谱纯乙醇稀释至1 000 μL ，加入100 μL 1.5 mol/L HCl 和400 μL 0.02 mol/L 9-羟基吨，漩涡振荡1 min使其混合均匀，室温避光衍生30 min，采用0.22 μm有机系针头式滤器过滤，待测。

色谱条件：色谱柱：C18色谱柱(Zorbax SB-Aq 250 mm × 4.6 mm，5 μm)，柱温：35 ℃，样品温度：25 ℃，荧光检测器：λex=234 nm，λem=600 nm，进样量：10 μL。 流动相A：0.02 mol/L乙酸钠(pH 7.2)，流动相B：乙腈，流速：0.8 mL/min。流动相洗脱梯度参照文献方法[18]。

标准曲线：以15 % vol的酒精水溶液配制具有一定浓度梯度的尿素标准液，按照与样品相同的处理方法分析测定。以尿素的峰面积为横坐标，尿素的浓度为纵坐标，建立标准曲线。

1.2.4分析方法

1.2.4.1总酸、总氨基酸态氮含量的测定

总酸、总氨基酸态氮的测定参照国标GB/T 13662—2008黄酒[19]。

1.2.4.2乙醇、总糖的测定

乙醇、总糖的测定参考文献方法[20-22]。

1.2.5风味物质测定

方法[16]，采用顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction，HS-SPME) 和气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)联用技术测定黄酒中的风味物质，顶空固相微萃取：取8 mL酒样于20 mL顶空瓶中，加入3.1 g NaCl进行饱和，并加入内标溶液10 μL (丙酸辛酯，终浓度55.8 μg/L；己酸甲酯，终浓度95.6 μg/L)，旋紧瓶盖，进行HS-SPME。萃取条件：采用三相萃取头(DVB/CAR/PDMS，50/30 μm)，于50 ℃下预约5 min，后萃取吸附45 min，并在250 ℃下GC解吸5 min。

GC条件：色谱柱为DB-Wax(60 m × 0.32 mm × 0.25 μm)；升温程序：50 ℃下保持2 min，以4 ℃/min的速率升温至230 ℃，并保持15 min；进样口温度250 ℃，载气He，流速2 mL/min；进样量1 μL，不分流。MS条件：EI电离源，离子源温度230 ℃，电子能量70 eV，扫描范围35.0 ～ 350.0。

采用内标法计算半定量结果，保留时间在己酸甲酯之前的化合物以己酸甲酯为内标，保留时间在己酸甲酯之后的化合物以丙酸辛酯为内标，目标化合物的峰面积积分采用选择离子模式(SIM)。

2　结果与讨论

2.1吸附材料的筛选

选取了25种不同类型的食品级吸附材料，对尿素初始浓度为10.01 mg/L的黄酒进行处理，考察树脂对尿素的吸附效果，结果如图1所示。结果表明，不同吸附材料对尿素的吸附效果差异很大，除了部分阳离子交换树脂外，大部分树脂对黄酒中尿素的去除率较低，约20%左右，有些材料基本无吸附效果(如树脂C、V、W)。铜离子和锌离子螯合材料对尿素的去除率也较低，约为18%，远低于文献报道的水平[12-13]，可能是黄酒中尿素的浓度(5～40 mg/L)远低于医学研究中尿素的浓度(2～3 g/L)，低浓度的尿素严重影响重金属螯合材料的吸附效果，当尿素浓度较低时，重金属螯合材料几乎无吸附作用。相比之下，部分阳离子交换树脂对尿素的吸附效果较好，尤其是强酸性阳离子交换树脂(N、O、P、Q)和弱酸性阳离子交换树脂(R)，其对尿素的去除率均在40%以上。

图1　不同吸附材料对尿素的去除率Fig.1　The removal efficiency of urea by various adsorption materials

材针对这料编号5种吸附效果较好的吸附材料，进一步考察树脂吸附后对酒样主要理化指标的影响，其测定结果如表2所示。结果比较发现，经强酸性阳离子交换树脂(N、O、P、Q)吸附处理后，虽然尿素的吸附去除率均超过80%，酒样的总糖和乙醇也基本变化不大(变化率均<10%)，但对总氨基酸态氮和总酸有显著影响，总氨基酸态氮的去除率几乎与尿素相当，总酸的变化率也>40%。可能是在黄酒的酸性条件下，大部分氨基酸也与树脂发生H+交换而被吸附，造成总氨基酸态氮减少，总酸度增加。因此，这些树脂可能不适宜作为黄酒中尿素的处理材料。相比之下，弱酸性阳离子交换树脂(R)虽然对尿素的吸附交换能力相对较弱，但对总氨基酸态氮和总酸影响也较小(变化率均<14%)，吸附后其含量仍然在国标范围内(清爽型半干黄酒：总氨基酸态氮≥0.5 g/L；总酸2.5～7.0 g/L)[19]，且处理后酒样的色、香、味与原酒比较接近，故弱酸性阳离子交换树脂(R)可能可以用于吸附处理黄酒中的尿素，以下进一步对该树脂处理进行考察。

表2　吸附处理前后黄酒主要常规指标分析

2.2树脂处理条件对去除黄酒尿素效果的影响

2.2.1理温度对尿素去除效果的影响

由于树脂离子交换作用吸附尿素属于化学吸附过程，温度对化学吸附有一定的影响，研究首先考察了在不同温度下树脂吸附处理尿素的效果。针对尿素浓度较高的黄酒样品(尿素浓度37.5 mg/L)，尿素的去除率随处理温度的变化如图2所示。结果表明，升高处理温度可以提高尿素的去除率，而当处理温度高于40 ℃后，温度的增加对于提高尿素的吸附去除率基本没有影响。考虑到处理成品黄酒，温度太高可能对酒体产生不良影响，故采用40 ℃作为最佳处理温度。

图2　处理温度对尿素去除率的影响Fig.2　Effect of temperature on the removal efficiency of urea

2.2.2处理时间对尿素去除效果的影响

进一步考察吸附处理时间对尿素去除效果的影响。在40 ℃树脂吸附处理尿素去除率随处理时间的变化如图3所示。由结果可知，处理前24 h，尿素的去除率随处理时间逐渐增加，处理24 h后，尿素的去除率变化基本不大，考虑到长时间高温处理会对酒体产生不良影响，故采用24 h作为最适处理时间。

图3　处理时间对尿素去除率的影响Fig.3　Effect of time on the removal efficiency of urea

2.2.3树脂添加量对尿素去除效果的影响

考虑到树脂添加量较少时可能会出现吸附饱和现象，故在得到的较优条件下，考察不同树脂添加量对尿素去除率的影响，结果如图4所示。

图4　树脂添加量对尿素去除率的影响Fig.4　 The removal efficiency of urea with different resin addition

树脂添加量较少时，适当增加树脂添加量可以提高尿素的去除率，但当树脂添加量超过10%时，尿素去除率基本保持不变。基于经济性考虑，采用10%的树脂添加量为宜。

2.3尿素浓度不同对吸附效果的影响

由于不同黄酒尿素含量差别较大，尿素浓度的高低可能会对树脂的吸附效果有一定的影响。在以上研究得到的处理条件下，吸附处理尿素浓度不同的6种黄酒样品，考察尿素浓度对吸附效果的影响，结果如表3所示。通过对不同尿素浓度(5～37 mg/L)的黄酒进行吸附处理，尿素的去除率在32%～49%之间。不同黄酒间尿素去除率存在差异，可能是由于不同黄酒成分不同，可能影响树脂对尿素的吸附。其中，尿素浓度最高(37.5 mg/L)的黄酒样品，尿素的去除率(48%)和树脂吸附量(182.47 μg/mL)均较高。对于尿素浓度相对较低的黄酒(低于10 mg/L)，尿素的去除率也在40%左右，可知该树脂对尿素浓度较低的黄酒仍然适用。然而，对于尿素浓度较高的黄酒(如酒样3、4、5、6)，经过一次吸附处理后其尿素浓度仍然较高(高于10 mg/L)，为了进一步降低黄酒中尿素的浓度，对于高尿素浓度的黄酒考虑采用多次吸附处理。

表3　不同尿素浓度黄酒树脂吸附效果

2.4高尿素浓度黄酒的多次吸附处理

为考察多次吸附处理效果，选择中、高尿素浓度的黄酒样品3和6进行多次吸附处理，每次吸附后尿素和其它理化指标的变化情况如表4所示。

表4　多次吸附处理的结果比较

注：0 -处理前；1-一次处理；2-两次处理；3-三次处理。

多次吸附处理的结果表明，对于中等尿素浓度的黄酒样品3和高尿素浓度的样品6，分别经过2次和3次吸附处理后，尿素的浓度均降至4 mg/L以下，而且多次吸附后黄酒的主要理化指标均变化不大。经过多次吸附处理，2个样品的尿素最终去除率分别达到75.72%和89.79%，效果明显。值得注意的是，对于这2个样品，后一次吸附尿素的去除率均高于前一次处理，可能是因为前一次吸附处理降低了可能影响尿素吸附的一些竞争性物质，在后一次吸附中尿素可以更有效地与树脂发生交换吸附。以上结果表明，当尿素浓度较高时可以采用多次吸附处理将黄酒尿素的浓度进一步降低。

2.5树脂吸附处理对黄酒风味物质的影响

将上述多次吸附处理的两组黄酒样品进一步进行主要风味成分分析，以考察树脂吸附处理对黄酒风味物质的影响，分析结果如表5所示。测定结果表明，即使经过多次处理，两组黄酒样品中主要风味成分总体差异也不大，吸附后的酒样比较完整地保持了原酒样的风味骨架体系。可见，这种树脂吸附方法能够较特异性吸附黄酒中的尿素，经过多次吸附处理后黄酒的风味仍然能较好地保持。

3　结论

本研究从多种不同类型的吸附材料中，通过筛选获得了有效吸附黄酒中尿素的树脂材料，在不明显影响黄酒主要理化指标的情况下，该树脂对尿素的吸附去除率可达40%。针对尿素浓度较高的黄酒样品，对树脂吸附条件进行了考察，得到了较优的处理条件：温度40 ℃；树脂添加量为10%；处理时间24 h。在此条件下吸附处理不同尿素浓度 (5～37 mg/L)的6种黄酒，尿素的去除率为32%～49%。该方法对于尿素浓度较低的黄酒样品有较好的处理效果(尿素去除率40%左右)。对于尿素浓度较高(大于15 mg/L)的黄酒，通过多次吸附处理，也可将尿素浓度降低至4 mg/L以下，且可以较好地保留黄酒的主要风味成分。虽然目前的处理条件对于生黄酒处理尚存在一定的风险，距离实际工业应用还有一定的距离，但通过进一步改进树脂吸附性能和优化处理条件，如缩短吸附时间、对贮存前的黄酒进行处理等，都有可能满足实际生产应用的要求。同时将树脂材料再生处理重复使用也可降低处理成本。本研究在不改变黄酒酿造微生物和酿造工艺的条件下，为成品黄酒中尿素的去除提供了一条较为经济、安全和有效的新途径。

表5　吸附处理对黄酒主要风味物质的影响

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Removal of urea in Chinese rice wine by resin adsorption

GUO Shuang-li, WANG Dong*, XU Yan

(Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education Synergetic Innovation Center for Food Safety and Nutrition，Laboratory of Brewing Microbiology and Applied Enzymology, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Ethyl carbamate in Chinese rice wine (Huangjiu) is formed mainly by the reaction between urea and ethanol. It is very important to reduce the concentration of urea for EC control. In this work, adsorption materials were screened for removing urea in rice wine, and an adsorption resin with effective adsorption of urea was obtained. The optimized adsorption conditions for the resin were as follows: the addition of resin was 10% (v/v), the temperature was 40 ℃, the adsorption time was 24 h. Under the treatment conditions, the removal efficiencies of urea were 32%-49% for different samples with different concentration of urea. For the rice wines with higher urea concentration (>15 mg/L), the concentration of urea could be reduced to less than 4 mg/L after several adsorption treatments. Moreover, significant changes of main flavor components in the wines were not founded after multi-adsorption treatments. This work provided a safe and effective approach for the removal of urea in Chinese rice wine, without changing the fermentation process and microorganisms.

Chinese rice wine (Huangjiu); urea; resin; adsorption

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608001

硕士研究生(王栋为通讯作者，E-mail: dwang@jiangnan.edu.cn)。

国家高技术研究发展计划 (863 计划， 2013AA102108)； 江苏省高校优势学科建设工程资助项目

2016-03-01，改回日期：2016-03-17