太赫兹波段超材料在核酸恒温指数扩增检测上的应用*

李永川，王思江，毛洪艳，颜识涵，刘毅，魏东山，夏良平*，黄庆*

（1.第三军医大学西南医院检验科，重庆400038；2.中国科学院重庆绿色智能技术研究院，跨尺度制造技术重庆市重点实验室，重庆400714）

太赫兹波段超材料在核酸恒温指数扩增检测上的应用*

李永川1，王思江2，毛洪艳2，颜识涵2，刘毅2，魏东山2，夏良平2*，黄庆1*

（1.第三军医大学西南医院检验科，重庆400038；2.中国科学院重庆绿色智能技术研究院，跨尺度制造技术重庆市重点实验室，重庆400714）

超材料对电磁场具有介电环境敏感和局域电场增强等奇特的电磁特性，近年来广泛用于无标记生物检测。文中设计并制作了一种金属开口谐振环阵列结构的超材料，在太赫兹波段下分别检测核酸恒温指数扩增前后反应体系，在氮气干燥环境下，扩增反应前后的频率偏移量分别为Δf1=（54±3）GHz、Δf2=（60±5）GHz。实验结果显示金属开口谐振环阵列结构的超材料可以作为一种生物传感器快速无标记检测核酸扩增前后的变化。

太赫兹；超材料；金属开口谐振环阵列

EEACC：7230doi：10.3969/j.issn.1004-1699.2016.09.007

太赫兹THz（Terahertz）波是指频率为0.1 THz～10 THz的电磁波，它具有独特的优点：能量低，不会对生物大分子产生破坏作用［1］；相干性，可通过获得THz的相位和幅度变化，得到生物大分子的吸收系数和折射率［2］；指纹谱特性，生物大分子的内/间的弱相互作用力和骨架振动等正好位于THz频谱范围［3］。因此，近年来，THz技术在生物医学检测领域的研究越发受到重视。但由于目前THz生物检测技术的灵敏度较低，不能有效检测微量的生物大分子，因此，发展一种操作简便、可进行高灵敏THz生物检测的通用手段逐渐成为大家研究的焦点。

超材料MMs（Metamaterials）主要是由周期性排列的亚波长谐振单元和载体构成的人工复合电磁材料［4］，它具有奇异的电磁谐振特性，如异常透射［5］、局域电场增强［6］、介电环境敏感［7］等特性。在入射THz波的作用下，通过超材料的局域场增强特性，可增强超材料与生物分子之间的相互作用，籍此可提高THz生物检测的灵敏度。如Hee-Jo Lee等［8］设计的双环金属开口谐振环DSRRs（Double Split-ring Resonators）共振频率为12.35 GHz，能够分辨出单链DNA与互补链杂交后的前后变化。Wu Xiaojun等［9］设计了一种简单的矩形单开口SRRs，利用0.4 THz和1.2 THz的两个共振频率频率偏移量的组合，检测了不同浓度的链霉亲和素。

恒温指数扩增反应EXPAR（Isothermal Expo⁃nential Amplification Reaction）是近几年发展的一种核酸扩增反应。它在DNA聚合酶和切口酶作用下，反复进行“切割-延伸-链置换”，等温条件下即可快速对短链DNA（8-16碱基）进行指数扩增［10］，一般能够在10 min之内对靶目标DNA扩增到106倍～109倍［11］，从而能够从溶液中众多生物大分子中选择性极端放大靶DNA，间接提高THz技术在生物大分子检测应用的灵敏性。

本论文提出了一种几何结构为五环矩形金属开口的THz超材料生物传感器FSRRs（Five Split-ring Resonators），利用光刻工艺制作出了大面积的、结构均一性良好的传感器件。以核酸恒温指数扩增反应前后的反应体系为测试对象进行传感实验测试发现，相对于FSRRs本身的THz共振透射谱而言，扩增反应前体系的THz谱向低频移动了Δf1=（54±3）GHz，而扩增反应后体系的THz谱向低频移动了Δf2=（60±5）GHz的频移，取得了较高灵敏度的探测结果。

1　主要试剂和材料

VentR（exo-）DNA聚合酶、Nt.BstNBI内切酶、10×Thermopol反应缓冲液、10×NEBuffer 3.1缓冲液等以上试剂均购自美国New England Biolabs（NEB）公司；20×Evagreen荧光染料购自美国Biotium公司；灭菌双蒸水ddH2O购自北京鼎国昌盛生物公司；dNTPs购自美国Promega公司；引物Trigger和模板Template均购自上海生工公司；Secure-Seal™Adhesive Spacers垫片（美国Molecular Probes公司）；Tray-5000太赫兹时域光谱仪（Advanced Photonix Inc，美国API公司）。

1.1FSRRs结构的制备及表征

超材料的谐振频率与其结构和尺寸相关，文中所设计的FSRRs结构如图1（a）所示，衬底为硅，金属结构所选材料为金。应用光刻工艺制作FSRRs结构，制作流程为①镀膜：在洁净的硅表面蒸镀厚150 nm的金膜。②涂胶：将S1805正胶均匀旋涂在金膜表面，前烘、冷却。③曝光：采用URE-2 000A/55移动掩模曝光系统，在均匀涂胶的表面进行接触式定时曝光，然后显影。④湿法刻蚀：使用碘∶碘化钾∶水=6 g∶20 g∶100 mL的混合液，刻蚀金膜，之后用去大量离子水冲洗。⑤去胶：无水乙醇去除光刻胶，即可获得FSRRs结构。

图1　SRRs结构

经以上光刻工艺流程，制备得到的FSRRs如图1（b）所示。这一结果为10×偏光显微镜下的光学显微图像，可见该FSRRs是大面积均一的，这为它在THz生物检测中可重复利用提供了保障。该结构的细节放大图，如图1（b）中插图所示，为50×显微镜下的显微图像。结果表明，所制备的FSRRs的棱角分明，对应各金属环的形状、大小一致，结构参数如图1（a）所示：衬底硅的厚度h=500μm，金属环最外的边长l=48 μm，开口宽度g=2.5 μm，结构单元内的环与环之间距离p= 2 μm，结构单元之间的间距w=10 μm，金膜的厚度150 nm。

1.2核酸恒温指数扩增反应体系

核酸序列详细信息具体见表1。

表1　核酸序列

核酸扩增每管反应体系中各反应物质浓度为0.05 U/μL VentR（exo-）DNA聚合酶，0.05 U/μL Nt.BstNBI内切酶，400 μmol/L dNTPs，1×Thermopol反应缓冲液，0.5×NEBuffer 3.1缓冲液，1×Evagreen荧光染料，1pmol/L引物序列（Trigger），100 nmol/L模板序列（Tempalte），加入ddH2O使反应体系总体积至20 μL，60℃放入荧光定量PCR仪反应。

2　结果

在完成了FSRRs结构的制备后，下面将对其传感性能进行实验测试，所选取的测试对象为核酸恒温指数扩增反应前后的体系。采用太赫兹时域光谱系统（THz-TDS）TRay-5000，在透射模式下进行实验。在测量过程中，为减少空气中水对太赫兹波的吸收干扰，须将整个装置置于通入氮气流的玻璃箱中。在湿度低于2%，温度为（21.02±0.01）℃的环境下进行实验测试。

检测样品前，在FSRRs表面粘贴一空白区域为直径15 mm、厚度100 μm的垫片，THz波下检测并获得未放入样品前充满氮气环境的参考信号IReference和THz波透过洁净的FSRRs表面获得的信号IBare。测试核酸扩增反应前后方法为：在制备完成的SRRs表面上空白圆形区域，分别滴入核酸扩增前或扩增后的样品溶液8 μL和ddH2O 22 μL，然后轻微摇匀使混合液均匀分布在空白的圆形区域，50℃烘干后分别检测，得到透射谱结果为IPre-amplification和IAfteramplification。FSRRs、核酸扩增反应前体系和反应后体系归一化透过率分别为

将检测获得的数据经过归一化处理后获得的透过率结果如图2所示。未加入样品前，超材料结构的谐振频率处位于1.33 THz处。分别加入核酸扩增前溶液和核酸扩增后溶液并进行烘干后，经多次重复实验发现：与超材料结构本身的THz透射谱相比，核酸扩增前的溶液的THz透射谱向低频偏移了（54±3）GHz，而扩增后则为（60±5）GHz。可见，所制备得到的超材料结构对核酸恒温指数扩增的反应前后的差异具有较高的灵敏度，适用于THz生物检测。

图2　恒温核酸指数扩增反应前后的检测结果

3　讨论

所制备的FSRRs结构在入射THz波的驱动下，可等效为一电容-电感LC（Inductor-Capacitor）回路，它的开口处可等效为电容器，其余金属环部分可等效为电感，其共振频率为［12］

式中，Leq为等效电感，主要为FSRRs的结构参数决定；Ceq为等效电容，与FSRRs结构周围的媒质的介电常数有关。将待测物质加入到FSRRs结构表面时，其周围环境的介电常数将会增大，从而导致Ceq减小，最终引起体系的共振频率f向低频移动。根据O’Hara J F的理论［13］，谐振环阵列结构的整体电容

式中，C1为硅基底的电容，C2为硅基底与金属阵列结构之间的电容，C3为金属阵列结构的电容，C4为金属阵列与待测物质间的电容，C5为待测物质的电容。由于文中检测核酸扩增前后使用的FSRRs结构相同，故待测物质电容C5的改变是引起共振频率偏移量不同的原因。待测物质电容C5是指FSRRs结构上滴加的溶液中各个组成成分在烘干后的电容C值之和。而EXPAR本质上是将反应溶液中大量游离的dNTPs合成多核苷酸链，溶液中使用的酶、蛋白质、盐离子等在扩增前后的量几乎不会有变化，烘干后，这些物质的在FSRRs结构单元上产生的电容C几乎相同，所以扩增前溶液体系中游离的dNTPs和扩增后溶液体系中的多核苷酸链的C值不同导致了待测物质电容C5的不同，从而引起反应体系前后THz透射谱的频移量不同。

超材料可作为一种生物传感器应用于THz生物检测，得益于许多生物大分子的集体振荡模式位于THz波段。如果将具有奇异电磁谐振特性的超材料和生物大分子进行特异性结合，将会有效提高传感器的灵敏度。另外THz技术尚未突破THz对水敏感性的限制，生物医学样本中液态水和检测环境中的水蒸气会导致严重的THz波水吸收干扰，结果通常是在干燥状态下进行测量。然而，许多生物大分子只有在水溶液环境中才有生物活性，导致THz波段下超材料生物传感器在生物医学上实际应用遇到了瓶颈，这促使我们应着重加强研究THz技术在水相环境中的应用。

本文结合THz波的快速、无标记和超材料的高灵敏度检测的优势，利用THz-TDS检测并得到了核酸恒温指数扩增反应前后体系的共振频率偏移量。相较于FSRRs结构本身而言，由于核酸扩增前后反应体系的等效电容Ceq不同，导致反应前后体系的频率偏移量分别为（54±3）GHz、（60±5）GHz。可见，THz波段超材料可作为一种高灵敏度生物传感器应用于核酸扩增检测。但是基于生物医学实际需求，还需进一步研究THz水敏感性的问题，随着THz技术的发展和超材料微结构加工技术的提高，THz波段下超材料生物传感器将会得到更广泛的应用。

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李永川（1989-），男，在读硕士，2013年毕业于四川大学，获得医学学士学位，现就读于第三军医大学攻读硕士，主要从事于太赫兹波在生物大分子的应用研究，yongchuanli511@163.com；

夏良平（1986-），男，博士，重庆中科院绿色智能技术研究院助理研究员，主要从事微纳光学理论、微纳加工工艺与器件、金属表面等离子体、亚波长金属结构以及在生物传感方面的应用研究；

黄庆（1972-），男，博士，第三军医大学西南医院检验科副主任、教授、主任医师、博士生导师；兼任西南大学硕士生导师，主要从事分子诊断学方面研究。

Detection of Isothermal Exponential Amplification Reaction Using Terahertz Metamaterials*

LI Yongchuan1，WANG Sijiang2，MAO Hongyan2，YAN Shihan2，LIU Yi2，WEI Dongshan2，XIA Liangping2*，HUANG Qing1*
（1.Department of Medical Laboratory，Southwest Hospital of the Third Military Medical University，Chongqing 400038，China；2.Research Center for Terahertz Technology，Key Laboratory of Multi-scale Manufacturing Technology，Chongqing Institute of Green and Intelligent Technology，Chongqing 400714，China）

Metamaterial has a dielectric environmentally sensitive and local electric-field enhancement in electro⁃magnetic field，It was widely used in label-free biodetection in recent years.We designed and fabricated a metama⁃terial structure assembled by split ring resonator.Before and after the isothermal exponential amplification reaction system were detected at the terahertz band.In dry nitrogen gas environment，the resonance frequency offset were Δf1=（54±3）GHz and Δf2=（60±5）GHz at before and after reaction.The experimental result show that the metamateri⁃al assembled by split ring resonator can be used as a biosensor for rapid label-free detection in changes of before and after nucleic acid amplification.

terahertz；metamaterials；split ring resonators

O456

A

1004-1699（2016）09-1341-04

项目来源：国家重点基础研究发展计划项目（2015CB755400；2015CB755402）；国家自然科学基金重点项目（81430054）；物理与生物医学交叉实验室孵化基金项目（WSS-2012～501）

2015-12-24修改日期：2016-05-03