卡拉干斯齿线虫的形态及ITS和COⅠ序列分析

张淑熠，吴　杰，郑刘梦，卜艳珍

(河南师范大学生命科学学院，河南新乡 453007)



卡拉干斯齿线虫的形态及ITS和COⅠ序列分析

张淑熠，吴杰，郑刘梦，卜艳珍*

(河南师范大学生命科学学院，河南新乡 453007)

利用光学显微镜和PCR扩增技术，对采自河南省马肠道内的卡拉干斯齿线虫(Skrjabinodentuscaragandicus)进行形态学观察和分子序列测定。结果表明，卡拉干斯齿线虫中等大小，口囊壁呈“S”状，前端极度膨大，厚度10 μm～12 μm，后端稍薄，约4 μm～6 μm，外叶冠由8个长而宽的小叶组成，内叶冠由16个～18个短而宽的小叶组成，食道漏斗发达；雄虫生殖锥长337 μm，引器长245 μm；所测核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(ITS)及5.8S片段长度为853 bp，其中ITS1长369 bp，ITS2长331 bp，ITS1区的GC含量(47.2%)明显高于ITS2区(40.7%)；线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因长度为393 bp，A、T、G、C碱基含量分别为25.2%、42.7%、21.4%、10.7%。卡拉干斯齿线虫在河南省属首次报道，为河南省新记录种。

马；卡拉干斯齿线虫；形态特征；rDNA-ITS；COⅠ基因

卡拉干斯齿线虫(Skrjabinodentuscaragandicus)隶属于圆线目(Strongylida)圆线科(Strongylidae)斯齿属(Skrjabinodentus)，主要寄生于马属动物(马、驴、骡等)消化道内，是一种罕见的寄生线虫[1-3]。Funikova S V首次在马肠道内发现该线虫，命名为卡拉干毛线虫(Trichonemacaragandicus)，并做了详细描述[4]。1957年，Tshoijo U[5]根据卡拉干毛线虫交合伞背肋的形状，为其建立了斯齿属。随后，孔繁瑶[6]采纳了Tshoijo U的观点，将卡拉干毛线虫更名为卡拉干斯齿线虫。Lichtenfels J R[7]认为，Tshoijo U所建立的斯齿属是依据一些极其特别的鉴别特征，故不予考虑，将卡拉干斯齿线虫作为待考种论。而德国学者Hartwich G[8]将卡拉干斯齿线虫作为待考种放入杯冠属(Cylicostephanus)，把斯齿属作为杯冠属的同属异名。但是，Dvojonos G M和Kharchenko V A[9]却承认斯齿属为一个有效的属，这个观点得到许多分类学者的赞同[3,10]。

卡拉干斯齿线虫曾记载于亚洲和前苏联[2]，一些学者也给出了详细的形态描述[3-4]。虽然在我国的蒙古、新疆和陕西等地也有该线虫的记录[11]，但未见相关的描述和绘图。而且，迄今国内外仍然缺乏关于卡拉干斯齿线虫分子学方面的报道。本研究首次在河南省发现卡拉干斯齿线虫，并对其进行形态特征描述以及分子序列的测定与分析，以期为今后的相关研究提供基础资料。

1　材料与方法

1.1材料

从河南省驴的肠道内得到2条雄性卡拉干斯齿线虫，固定保存于700 mL/L酒精中。经固定的标本先用乳酸苯酚溶液(2份甘油、1份苯酚饱和溶液、1份乳酸、1份水)透明，然后在光学显微镜下进行形态观察、测量和显微拍照。标本保存于河南师范大学生命科学学院。

1.2方法

1.2.1虫体总DNA的提取 从固定液中取出单个虫体，先用去离子水反复冲洗2 h～3 h，然后将头尾切掉重新放回原液中，以便与分子鉴定结果核对。剩余部分置于一新的1.5 mL Eppendorf管中，用灭菌的剪刀将虫体剪碎，然后加入含蛋白酶K的消化液，放于37℃恒温水浴锅内消化过夜。消化好的虫体悬液采用UNIQ-10柱式基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司生产)提取基因组DNA，于-20℃保存。

1.2.2PCR扩增和纯化用于扩增核糖体DNA (rDNA)内部转录间隔区(ITS)的一对保守引物为：NC5(正向)5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′,NC2(反向)5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′。用于扩增线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ(COⅠ)基因的一对保守引物为：JB3(正向)5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′和JB4.5(反向)5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′。引物由苏州金维智生物科技有限公司合成。

ITS的扩增体系为30 μL，2×TaqMaster Mix 15 μL，ddH2O 10.5 μL，正向引物NC5(1 pmol/μL)1 μL，反向引物NC2(1 pmol/μL)1 μL，模版DNA 2.5 μL。PCR反应条件为：94℃ 5 min;94℃ 45 s，56℃ 1 min，72℃ 1.5 min，35个循环;最后72℃ 7 min。

COⅠ的扩增体系为30 μL，包括2×TaqMaster Mix 15 μL，ddH2O 7.5 μL，正向引物JB3(1 pmol/μL)1.5 μL，反向引物JB4.5(1 pmol/μL)1.5 μL，模板DNA 4.5 μL。PCR反应条件为：94℃ 5 min;94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，35个循环;最后72℃ 10 min。

PCR扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，于紫外透射仪中观察，并于凝胶成像系统中拍照。然后在紫外灯下将含有目的DNA片段的凝胶切下来，用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒纯化回收。

1.2.3序列测定和分析纯化后的PCR产物送往上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。测序结果用DNA Star 7.1软件进行拼接，所得序列采用Clustal X1.83和MEGA5软件比对分析。序列提交至GenBank，获得序列注册号，并用Blast软件进行同源性检测。

2　结果

2.1虫体形态特征

虫体中等大小。口领显著，口领的后缘位于口囊前缘之前。口领的两侧各有1个头感器，头感器小，稍微隆起。2个头感器之间对称排列着4个较发达的亚中乳突，乳突呈子弹形，突出于口领之上。口孔周围具2圈叶冠，外叶冠由8个长而宽的小叶组成，内叶冠小叶较短，约16片～18片。口囊近似圆柱形，宽度大于深度，口囊壁呈“S”状，前端极度膨大，后端较薄。背沟发达，约为口囊深的1/3～2/3。食道漏斗发达，具有1个大的背食道齿和2个亚腹食道齿。食道短而粗壮，呈花瓶状。神经环位于食道约1/2处，排泄孔位于神经环后端(图1A～图1C)。

A.虫体前部腹面观；B，C.虫体前部侧面观；D.雄虫尾部腹侧面观；E，F. 雄虫尾部侧面观(图中比例尺：A，B，D～F=200 μm；C=100 μm )

A.Anterior end,ventral view;B，C.Anterior end,lateral view;D.Posterior end of male,ventral-lateral view;E，F.Posterior end of male,lateral view(Scale-bars:A，B, D-F=200 μm;C=100 μm )

图1卡拉干斯齿线虫光镜图

Fig.1Light microscopic graphs ofSkrjabinodentuscaragandicus

雄虫(n=2)：体长9.85 mm～9.90 mm，最大体宽543 μm。口领高10 μm～13 μm，口领和体部交界处宽60 μm。口囊壁前端厚10 μm～12 μm，后端较薄，约4 μm～6 μm；口囊内径前端宽 34 μm～39 μm，后端宽44 μm～52 μm；深18 μm～26 μm。食道长337 μm～358 μm，前端部宽85 μm～98 μm，后端膨大部宽 108 μm～122 μm。神经环距头端185 μm～188 μm；颈乳突距头端247 μm～256 μm。雄虫尾部交合伞短阔，背叶稍长于侧叶，背叶和侧叶分界不明显。交合伞自外背肋基部至背肋末端的长度为454 μm～469 μm。交合刺1对，等长，末端有钩，长1.06 mm～1.08 mm。引器粗壮，柄部退化，远端具翼，长245 μm。生殖锥发达，呈圆锥形，长337 μm，延伸超过交合伞侧叶(图1D～图1F)。

2.2ITS序列分析

将所测的1条ITS序列(包含5.8 S)提交至GenBank数据库，获得登录号为KT984870。ITS序列总长853 bp，其中ITS1长369 bp，5.8 S长153 bp，ITS2长331 bp； ITS1区的GC含量(47.2%)明显高于ITS2区(40.7%)(图2)。在GenBank检索中，尚未发现卡拉干斯齿线虫或斯齿属内其他虫种的序列。经过Blast同源比对，与伊氏双齿口线虫(Bidentostomumivashkini)(登录号：KP693440)的同源性最高，达到94%；而与杯冠属内小杯杯冠线虫(C.calicatus)(登录号：KM085356)、微小杯冠线虫(C.minutus)(登录号：KM085360)、长伞杯冠线虫(C.longiburs)(登录号：KM085358)和高氏杯冠线虫(C.goldi)(登录号：KM085357)的同源性较低，为74.45%～85.20%。

2.3COⅠ序列分析

本研究共测出1条COⅠ序列，提交至GenBank数据库获得登录号为KP693430。COⅠ序列长393 bp，A、T、G、C碱基含量分别为25.2%、42.7%、21.4%、10.7%。(图3)。在GenBank上经过Blast搜索，也未收录卡拉干斯齿线虫或斯齿属内其他虫种的COⅠ序列。与所测序列同源性最高的是绵羊夏柏特线虫(Chabertiaovina)(登录号：KF279334)，同源性为90%；而与杯冠属内小杯杯冠线虫(C.calicatus)(登录号：KM085347)、微小杯冠线虫(C.minutus)(登录号：KM085353)、长伞杯冠线虫(C.longiburs)(登录号：KM085351)和高氏杯冠线虫(C.goldi)(登录号：KM085349)的同源性仅有85.75%～88.04%。

图2　卡拉干斯齿线虫的ITS序列

图3　卡拉干斯齿线虫的COⅠ序列

3　讨论

1957年，Tshoijoji U[5]建立了斯齿属。1997年8月11日，在南非太阳城举办的马属动物寄生线虫国际研讨会上，斯齿属的有效性得到了承认[3]。斯齿属的主要鉴别特征如下：①雄虫交合伞背肋分为两个主支，每个主支仅分出一个侧支；②生殖锥特别长，延伸超出交合伞；③引器柄部退化，远端具翼。目前，该属共包括3种线虫：卡拉干斯齿线虫、陶氏斯齿线虫(S.tshoijoi)和长锥斯齿线虫(S.longiconus)。虽然前2种线虫在我国均有记载，但是却缺乏卡拉干斯齿线虫的形态描述。本研究首次在河南省发现该线虫并给出了详细描述和图片。本次所采标本的形态特征与Funikova S V[4]和Lichtenfels J R等[3]的报道基本一致，只是食道较长而粗壮，其他未发现明显差异。

随着分子生物学技术的发展，基于基因组DNA和线粒体DNA(mtDNA)的各种分子标记开始应用于线虫的分类研究中[12-17]。本文首次对卡拉干斯齿线虫的rDNA-ITS和COⅠ序列进行了测定和分析。在卡拉干斯齿线虫的分类史上，Hartwich G[8]曾将该线虫作为待考种放入杯冠属，把斯齿属作为杯冠属的同属异名。但是，将所测的ITS和COⅠ序列在GenBank中经过Blast搜索，结果发现，该线虫分别与伊氏双齿口线虫(94%)和绵羊夏柏特线虫(90%)的同源性较高，而与杯冠属内虫种的同源性却比较低，同源性分别为74.45%～85.20%和85.75%～88.04%。由此可知，将卡拉干斯齿线虫归入杯冠属是不合理的，也进一步证实了斯齿属的有效性。本研究填补了国内卡拉干斯齿线虫形态描述的缺失，并且首次提供了ITS和COⅠ序列数据，为今后该线虫的进一步研究奠定了基础。

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Morphological Descriptionand Sequence Analysis of ITS and COⅠ ofSkrjabinodentuscaragandicus

ZHANG Shu-yi,WU Jie,ZHENG Liu-meng,BU Yan-zhen

(CollegeofLifeScience,HenanNormalUniversity,Xinxiang,Henan,453007,China)

Skrjabinodentuscaragandicus, obtained from the large intestines of horses in Henan province, was observed using light microscopy.ITS and COⅠ sequences ofS.caragandicuswere amplified and sequenced using PCR techniques.The results showed thatS.caragandicusis medium-sized, walls of buccal capsule is S-shaped,much thicker anteriorly,the thickness of the front end is 10 μm-12 μm and the thickness of the posterior part is 4 μm-6 μm.The external leaf crown consists of 8 long and broad elements,and the internal leaf crown consists of 16-18 short and broad elements.S.caragandicuswith a well-developed esophagus funnel,the genital cone length of male is 337 μm,and the gubernaculums length is 245 μm;total length of rDNA-ITS is 853 bp, including 369 bp in ITS1,153 bp in 5.8 S and 331 bp in ITS2,and the content of G+C of ITS1 (47.2%) is significantly higher than that of the ITS2 (40.7%);the length of COⅠ is 393 bp,and A,T,G and C contents are 25.2%,42.7%,21.4%,10.7%,respectively.In the present study,S.caragandicuswas reported for the first time in Henan province.

horse;Skrjabinodentuscaragandicus; morphological characteristics; rDNA-ITS; COⅠ

2016-02-27

国家自然科学基金项目(31372163)；河南省重点科技攻关项目(112102110032，142102310121)

张淑熠(1991-)，女，河南登封人，硕士研究生，主要从事动物寄生线虫研究。*通讯作者

S852.731

A

1007-5038(2016)10-0053-04