内异康复片对EMT大鼠VEGF、MMP-9、HGF及Wnt4、Wnt5α的调控机制研究

黄映红，徐晓娟，秦旭华，王张，王秋香，李宛静

成都中医药大学，四川 成都 610075

◆实验研究◆

内异康复片对EMT大鼠VEGF、MMP-9、HGF及Wnt4、Wnt5α的调控机制研究

黄映红，徐晓娟，秦旭华，王张，王秋香，李宛静

成都中医药大学，四川 成都 610075

目的：分析内异康复片对子宫内膜异位症（EMT）大鼠异位内膜黏附、浸润及增生的调控作用，并探讨其作用机制。方法：建立子宫内膜异位症大鼠模型，随机分为模型对照组、阳性对照组、中药低、中、高剂量组，每组10只。治疗3周后，测量各组大鼠异位内膜体积；另取模型动物的异位内膜组织，分离异位内膜细胞，体外培养，设空白对照组、阳性对照组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组，每组4个复孔。采用ELISA法测定血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶（MMP）、肝细胞生长因子（HGF）含量；Western Blot检测Wnt4、Wnt5α的表达。结果：动物实验结果：与模型对照组比较，中药各剂量组、阳性对照组的异位内膜体积显著缩小，异位内膜厚度变薄，腺体面积减少，差异均有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）；中药高剂量组、阳性对照组的腺体数目显著少于模型对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；中药高剂量组VEGF、MMP-9含量显著低于模型对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。细胞实验结果：中药低、中、高各剂量组培养上清液的VEGF含量显著低于空白对照组，中药高剂量组MMP-9含量显著低于空白对照组，中药高剂量组和阳性对照组Wnt4、Wnt5α表达水平均显著低于空白对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。结论：内异康复片治疗EMT的机理可能与抑制异位内膜细胞分泌VEGF、MMP-9，以及调节Wnt信号转导通路有关。

内异康复片；EMT模型大鼠；血管内皮生长因子（VEGF）；基质金属蛋白酶-9（MMP-9）；肝细胞生长因子（HGF）；Wnt4；Wnt5α；动物实验

子宫内膜异位症（Endometriosis，EMT）属于传统中医学痛经、月经不调、癥瘕及不孕症等范畴，其发病机理是具有生长功能的子宫内膜组织在子宫内膜以外的部位生长、浸润、出血，形成结节及包块，从而引起女性下腹部疼痛，甚至不孕［1］。该病常见于育龄女性，发病率为10%～15%，且逐年上升［2～3］，为妇科难治性疾病之一。内异康复片是四川省中医院妇科数十年来治疗EMT的特色院内制剂，是疗效明确的临床验方。课题组前期研究表明［4～7］，该药可降低EMT模型动物血液黏度，改善微循环，促进异位内膜萎缩，抑制其血管生成等。本文以课题组前期研究为基础，对内异康复片治疗EMT的分子机制进行深入探讨。

1　材料与方法

1.1实验药物和试剂内异康复片由半枝莲、大血藤、熟大黄、桃仁、三棱、莪术、薏苡仁、土鳖虫、鳖甲等中药组成，0.3 g/片，由四川省中医院生产，批号：20120403；来曲唑片，每片2.5 mg，由江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号：2012-03-20。在进行离体实验时，取内异康复片于乳钵内捣碎，置锥形瓶中，加DMEM培养液（比例为0.1 g/mL），超声振荡助溶2 h，于4℃密闭浸泡72 h后，取上清液，0.22 μm微孔滤器过滤，得内异康复片贮存液，备用，实验时用DMEM培养液稀释至所需浓度；来曲唑片用DMEM培养液溶解，0.22 μm微孔滤器过滤后使用。DMEM培养基（批号：NXE0631，赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司）；无支原体胎牛血清（批号：111020，浙江天杭生物科学有限公司）；Rat-VEGF Elisa Kit、Rat-MMP-9 Elisa Kit（批号分别为：13051201、13051203，美国R&D公司进口分装）；Rat-HGF Elisa Kit（批号：RT130371，美国ADL公司进口分装）；wnt4、wnt5α抗体（批号：MAB1501，Santa Cruz公司）；二抗（批号：A5420，sigma公司）。

1.2实验动物分组、造模、给药及检测SD大鼠，SPF级，雌性，体重200～250 g，成都中医药大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（川）2013-24。雌性SD大鼠50只随机分为模型对照组，阳性对照组，中药高、中、低3个剂量组，每组10只。适应性饲养2周，监测大鼠动情周期，参考文献方法［8］，在动情期行手术异位移植子宫内膜，建立大鼠EMT模型。造模术后第21 d给药，中药高、中、低剂量组分别给予内异康复片1.512 g/kg（相当于成人剂量的14倍）、0.756 g/kg（相当于成人剂量的7倍）、0.378 g/kg（相当于成人剂量的3.5倍）灌胃，阳性对照组给予来曲唑片0.35 mg/kg（相当于成人剂量的7倍）灌胃，每天1次，连续21 d，模型对照组给予等体积生理盐水灌胃。末次给药后24 h眼眶取血，离心分离血清，采用ELISA法测定血清中VEGF、MMP-9、HGF含量。处死动物后分离其腹腔内的异位内膜组织，用两脚规测量异位内膜的体积长（mm）×宽（mm）×高（mm）［9］。并取异位内膜组织制备病理切片，行HE染色，观察各组大鼠异位内膜形态学差异，检测异位内膜腺体数量、腺体面积。实验中个别大鼠由于手术感染死亡，其中模型对照组死亡2只，阳性对照组死亡1只，中药高剂量组死亡2只。

1.3异位内膜细胞的培养及指标的检测EMT大鼠模型造模方法同1.2，造模第21天，无菌条件下取出异位内膜组织，此时异位内膜成囊泡状，囊泡内可见淡黄色透明积液者为造模成功的异位内膜组织。参考文献［10］方法，分离细胞并接种培养。分为空白对照组、阳性对照组，中药高、中、低剂量组，每组设4个复孔。阳性对照组加入终浓度为5×10-5mg/mL的来曲唑水提液，中药高、中、低剂量组分别加入终浓度为50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL的内异康复片水提液，空白对照组用等体积DMEM培养液代替受试药物，孵育48 h后，收集培养上清液，用ELISA法检测VEGF、MMP-9、HGF含量。0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞，反复冻融裂解细胞，取细胞裂解液行Western Blotting检测，测定异位内膜组织细胞内Wnt4、Wnt5α表达水平。Western Blot结果用Biorad公司的Quantity One软件分析，计算目的条带的相对灰度值，即目的蛋白的免疫印迹灰度与内参β-actin蛋白的灰度的比值，以表示目的蛋白的相对表达量，单位为DPI（dots per inch）。

1.4统计学方法HE染色及WesternBlotting结果用SPSS17.0进行统计分析；ELISA实验结果数据用《中国医学百科全书·医学统计学》统计软件包PEMS3.1进行统计分析。

2　结果

2.1各组大鼠异位内膜体积及内膜厚度比较见表1和图1。与模型对照组比较，中药各剂量组、阳性对照组的异位内膜体积显著缩小，差异均有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。中药各剂量组、阳性对照组的异位内膜厚度均显著小于模型对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。图1主要说明各组移植物的结构和生长情况，各组移植灶结构完整，由外向内依次为内膜层、肌层和浆膜层，提示建模成功。图1-A中箭头所指可见模型对照组异位内膜上皮细胞呈长柱状或假复层上皮细胞，间质较薄。图1-B～E中箭头所指可见阳性对照组及中药低、中、高剂量组异位内膜不同程度地萎缩变薄，异位内膜上皮细胞呈扁平状。

表1　各组大鼠异位内膜体积及厚度比较（±s）

表1　各组大鼠异位内膜体积及厚度比较（±s）

与模型对照组比较，①P＜0.05，②P＜0.01

组别模型对照组阳性对照组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组样本数（只）8 9 10 10 8异位内膜体积（mm3）19.69±1.60 6.89±1.6②15.50±1.06①12.01±0.89①8.00±1.60②异位内膜厚度（um）23.88±5.30 6.00±1.58①9.40±1.80①6.10±1.80①4.63±1.32①

图1　各组大鼠异位内膜病理切片 （HE染色，100×）

2.2各组大鼠异位内膜腺体数目、腺体面积比较见表2和图2。中药高剂量组、阳性对照组腺体数目显著少于模型对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；中药各剂量组、阳性对照组的腺体面积均显著小于模型对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。图2表明各组大鼠移植灶内腺体分布的情况。图2-A显示模型对照组异位内膜内有腺体分布，图中箭头所指可见腺上皮层较厚，上皮细胞为柱状；图2-B～E图中箭头所指可见，跟模型对照组比较，阳性对照组及中药低、中、高剂量组异位内膜中腺体数量显著减少、腺体面积明显缩小，腺上皮层变薄。

表2　各组大鼠异位内膜腺体数目、腺体面积比较（±s）

表2　各组大鼠异位内膜腺体数目、腺体面积比较（±s）

与模型对照组比较，①P＜0.05

组别模型对照组阳性对照组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组样本数（只）8 9 10 10 8腺体数目（个）12.50±5.80 3.44±2.60①10.50±4.48 9.40±6.31 4.50±2.56①腺体面积（mm2）4.17±1.03 0.96±0.47①2.96±1.09①1.43±0.31①1.20±0.60①

图2　各组大鼠异位内膜腺体病理切片 （HE染色，100×）

2.3各组大鼠血清中VEGF、MMP-9、HGF含量比较见表3。中药高剂量组VEGF、MMP-9含量显著低于模型对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.4各组大鼠异位内膜细胞分泌VEGF、MMP-9、HGF含量比较见表4。中药低、中、高各剂量组培养上清液的VEGF含量显著低于空白对照组；中药高剂量组MMP-9含量显著低于空白对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。

2.5各组大鼠异位内膜细胞中Wnt4、Wnt5α表达水平比较见图3、图4、表5。中药高剂量组和阳性对照组Wnt4、Wnt5α表达水平均显著低于空白对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。

表3 各组大鼠血清中VEGF、MMP-9、HGF含量比较（±s）ng/L

表3 各组大鼠血清中VEGF、MMP-9、HGF含量比较（±s）ng/L

与模型对照组比较，①P＜0.05

组别模型对照组阳性对照组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组样本数（只）8 9 10 10 8 V EGF 207.58±31.61 175.13±30.57 170.47±30.91 168.05±33.02 150.31±15.39①M M P-9 33.33±8.01 25.98±9.94 25.88±8.95 22.80±7.16 18.27±4.96①HGF 65.32±22.70 61.08±21.12 60.18±20.02 59.48±21.14 59.93±19.97

表4 各组大鼠异位内膜细胞分泌VEGF、MMP-9、HGF含量比较（±s，n=4）　ng/L

表4 各组大鼠异位内膜细胞分泌VEGF、MMP-9、HGF含量比较（±s，n=4）　ng/L

与空白对照组比较，①P＜0.05，②P＜0.01

组别空白对照组阳性对照组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组V EG F 129.25±19.02 105.13±23.89 97.13±14.77①91.38±28.26①83.48±24.07②M M P-9 26.67±7.52 19.31±6.10 20.88±4.69 17.80±6.07 13.43±6.96①H G F 28.65±9.45 26.08±9.54 25.18±6.80 21.15±9.43 18.27±6.46

图3　各组大鼠异位内膜细胞中Wnt4表达水平比较

图4　各组大鼠异位内膜细胞中Wnt5α表达水平比较

表5　各组大鼠异位内膜细胞Wnt4、Wnt5α表达水平比较（±s，n=4）

表5　各组大鼠异位内膜细胞Wnt4、Wnt5α表达水平比较（±s，n=4）

与空白对照组比较，①P＜0.05，②P＜0.01

组别空白对照组阳性对照组中药低剂量组W nt4（D PI）1.00±0.12 0.27±0.06②0.89±0.14 W nt5α（D PI）1.00±0.19 0.21±0.07②0.92±0.10中药中剂量组中药高剂量组0.74±0.08 0.43±0.05①0.79±0.12 0.46±0.11①

4　讨论

内异康复片中半枝莲清热解毒，大血藤活血通络［11～12］；桃仁活血祛瘀；薏苡仁健脾渗湿；土鳖虫、鳖甲破血祛瘀；三棱、莪术破血行气，全方具有清湿化瘀，行气止痛，消癥散结之效。临床应用该方治疗子宫内膜异位症取得了较好疗效，但对该方的作用机制尚需深入研究。Wnt/β-catenin信号通路在介导雌激素促进异位内膜细胞黏附、侵袭和血管生成过程中可能起着关键的作用［13～14］。该信号通路下游分子VEGF和MMP与EMT病变区微血管密度增高、异位内膜种植及生长关系密切，且VEGF与MMP的表达呈正相关［15］。VEGF是目前公认的最重要的促血管生成因子［16］，VEGF的高表达可能是决定异位内膜成功种植及生长的因素之一［17］。MMPs是参与基质降解最重要的酶类，MMPs可降解细胞外基质和基膜，诱导血管生成［18～19］。此外，HGF具有诱发上皮细胞迁移、侵袭以及诱发血管生成的多重功能［20～21］，临床研究发现，内异症患者血清中、腹腔液中HGF浓度均升高［22～24］。由此可见，Wnt信号分子在异位内膜细胞的特征性表达以及HGF等生长因子的大量分泌在EMT的发生发展过程中发挥着极为重要的作用。

本研究结果表明内异康复片能使异位内膜变薄、甚至萎缩，并可减少异位内膜内腺体数目、缩小腺体面积。内异康复片的上述作用与药物剂量呈正相关，提示临床治疗EMT可使用较大剂量的内异康复片。Wnt4、Wnt5α在异位内膜细胞特征性表达，血清和异位内膜细胞上清液中VEGF、MMP-9含量明显增加，说明Wnt信号通路可能参与了内膜细胞异位黏附-浸润性生长-血管生成的病理过程。内异康复片能下调EMT细胞中Wnt4、Wnt5α的表达水平，同时抑制异位内膜细胞分泌VEGF、MMP-9，并降低EMT大鼠血清中VEGF、MMP-9含量，提示内异康复片可能通过阻断Wnt信号通路以抑制异位内膜细胞分泌VEGF、MMP-9，从而防止异位子宫内膜的黏附、侵袭和血管生长。本研究探讨了内异康复片的作用机制，为更好指导临床用药提供了重要的实验依据。

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（责任编辑：冯天保，郑锋玲）

Regulatory Mechanism Study of Neiyi Kangfu Tablet on VEGF，MMP-9，HGF，Wnt4 and Wnt5α of Endometriosis Rats

HUANG Yinghong，XU Xiaojuan，QIN Xuhua，WANG Zhang，WANG Qiuxiang，LI Wanjing

Objective：To analyze the regulatory function of Neiyi Kangfu tablet on adhesion，infiltration and proliferation of Ectopic endometrial in rats with endometriosis（EMT）and to discuss its mechanism.Methods：Established rat models with endometriosis，and divided them into model control group，positive control group，Chinese medicine（CM）low-dose，mid-dose，high-dose group，10 cases in each group.After 3 week of treatment，endometriosis volume of rats in every group was measured.In addition，took endometriosis tissue and separated endometriosis cell，then cultured in vitro，divided into blank control group，positive control group，CM low-dose，mid-dose，high-dose group.Detected levels of vascular endothelial growth factor（VEGF），matrix metalloproteinase（MMP）and hepatocyte growth factor（HGF）by ELISA method，detected expression of Wnt4 and Wnt5α by Western Blot.Results：Comparing with model control group，endometriosis volume of CM every dose group and positive control group was decreased obviously，endometriosis thickness was thinned，gland area was reduced，the differences being significant（P＜0.01 or P＜0.05）.Gland numbers in CM high-dose group and positive control group were lower than that in model control group，the difference being significant（P＜0.05）.Levels of VEGFand MMP-9 in CM high-dose group were lower than those in model-dose group，the differences being significant（P＜0.05）. The levels of VEGF in culture supernate of CM low-dose，mid-dose，high-dose group were all lower than those in blank control group，the level of MMP-9 in CM high-dose group was lower than that in blank control group，expression levels of Wnt4 and Wnt5α were all lower than those in blank control group，the differences being significant（P＜0.05 or P＜0.01）. Conclusion：The mechanism of Neiyi Kangfu tablet for EMT can be related to inhibit endometriosis cell to secrete VEGF and MMP-9 and regulate Wnt signal transduction pathway.

Neiyi Kangfu tablet；Endometriosis model；Vascular endothelial growth factor（VEGF）；Matrix metalloproteinase（MMP）；Hepatocyte growth factor（HGF）；Wnt4；Wnt5α；Animal experiment；Rats

R285.5

A

0256-7415（2016）09-0217-05

10.13457/j.cnki.jncm.2016.09.097

2016-04-05

四川省中医药管理局应用基础研究项目（2012-F-020）；四川省科技厅基础研究计划项目（2013JY0184）

黄映红（1972-），女，副教授，研究方向：中西医结合基础研究。

徐晓娟，E-mail：847956379@qq.com。