子宫内膜异位症动物模型研究进展

金济云 夏亲华

[摘要] 本文对子宫内膜异症（EMs）动物模型的构建方法及优缺点综合阐述，希望建立合适的动物模型，加深EMs病因学、治疗学的研究，以深入了解EMs发病机制，开发治疗新药，探索中药作用机制，实现多方面、多角度的中西医结合治疗，全面提高中西医结合治疗EMs的水平。

[关键词] 子宫内膜异位症；动物模型；免疫机制；研究进展

[中图分类号] R711.71 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）02（b）-0028-04

Research progress of endometriosis animal models

JIN Jiyun1 XIA Qinhua2

1.The First School of Clinical Medicine， Nanjing University of Chinese Medicine， Jiangsu Province， Nanjing 210029， China； 2.Department of Gynaecology， Jiangsu Provincial Hospital of TCM， Jiangsu Province， Nanjing 210029， China

[Abstract] This paper makes a summarization for the construction method and advantages and disadvantages of endometriosis （EMs） animal models， try to establish more appropriate animal models for the study of etiology and treatment on Ems， so as to deeply know about the pathogenesis of Ems， exploit new drugs， explore mechanism of traditional Chinese medicine， realize combined treatment of traditional Chinese medicine and Western medicine from many aspects and angles， improve the level of combined treatment of traditional Chinese medicine and Western medicine for EMs comprehensively.

[Key words] Endometriosis； Animal models； Immune mechanism； Research progress

子宫内膜异位症（EMs）是指有活性的子宫内膜在被覆内膜的宫腔和子宫以外的部位生长、浸润，从而引发疼痛、结节、月经紊乱以及不孕等症的疾病。EMs的病变范围较广，形态多样，有较强的侵袭性和复发性，且有1%的恶变率[1]。但自1860年首次报道EMs以来，我们对其发病机制了解有限，且目前的治疗策略不能彻底治愈EMs，临床上复发及患者难以忍受的不良反应频见。因此，建立动物模型对EMs的研究至关重要。本文希望通过对造模方法优缺点的探讨，总结近年来EMs模型建立的经验教训，建立更为仿真的EMs动物模型。

1 动物模型的选择

EMs动物模型的制作主要基于Sampson的“经血逆流种植学说”[2]，现造模方法有自发、种植、诱发三种主要模式。

1.1 自发性

见于人或灵长动物，其病理学特征及病机和人类最为相似，但发生率低，周期长，短期内无法获得足够的信息，且价格昂贵，限制了其在科研中的应用。

1.2 种植性（异体移植）

多见于重症联合免疫缺陷（SCID）小鼠或裸小鼠，有同种异体和异种异体之分，均有创伤小、易操作、成活率高等优点。但是实验动物均为免疫缺陷动物，无法用于EMs免疫学机制及免疫治療方面的研究。

1.3 诱发性（自体移植）

造模对象较广，如猴、兔、大鼠等。将其自体内膜通过手术种植到宫腔外，或闭锁其宫颈，使经血逆流而诱发。此法避免了排斥反应，但自体手术移植损伤大且死亡率高。

总之，目前造模方法各有利弊，选择条件以实验的目的和可行性而异，权衡各种模型的利弊，充分发挥不同动物模型的长处。相较而言，异体移植有较明显的优势。人内膜组织异体移植，使其生理病理改变更接近人体，但是有伦理学问题存在。同种异体研究成果是否可以完全适用于人体有待商榷。此外，免疫功能的缺乏限制了EMs免疫机制的研究，如何重建裸鼠免疫功能值得探索。

2 造模取材对模型的影响

2.1 关于取膜的生理期

有学者认为内膜处于增生状态更易种植，也有学者认为分泌期、分泌晚期甚至月经期能更好地模拟经血逆流种植学说，且成模率更高。而Nisolle等[3]发现所有移植物均有类似增殖期变化的形态学表现，认为不同的取膜时期对裸鼠模型的构建并没有影响。许艳丽等[4]分别观察了增殖期及分泌期内膜间质细胞培养的成功率，发现移植细胞成活率与月经周期没有必然联系。

2.2 关于取膜部位

根据“在位内膜决定论”以及许多学者在构建Ems裸鼠模型过程中的发现[5]，认为在位内膜比正常内膜更具有侵袭性，其生长率高于正常内膜。朱启江[6]的试验中各组织生长率：正常子宫内膜60%；腺肌症在位内膜85.71%；卵巢巧囊内壁100%。Banu等[7]成功将混合的人异位内膜上皮和间质细胞接种于裸鼠腹腔形成异位病灶，发现其与EMs患者异位病灶在分子与细胞学方面相似，可以用来研究在位内膜本身固有的、潜在的侵袭能力。Van Langendonckt等[8]以近100%的成功率将人异位组织注入裸鼠腹腔，并可在体内存活10周之久。移植后组织保持了原有的特征和对激素的反应。据此可以推断：异位内膜的生长率更高，而且能更准确地再现EMs的特点，反映其发展变化。

3 观察方法

既往所使用的有创性观察方法，除了耗损动物外，无法明确区分病灶及周围组织，且无法对同一病灶实时监测。实验及临床研究要求我们研发出EMs模型的活体无创观察方法。目前主要分为两类：一、利用影像学方法对病灶进行检测；二、利用分子生物学技术标记病灶并进行观察。

3.1 影像学方法

MRI利用建立的图像获得病灶信息，有效地减小了动物的应激反应，并可直接进行数据分析。此法可相对较早地观测到异位病灶，但无法区分不典型EMs病灶，如粘连。超声检查也常在EMs动物模型研究中应用。此外，微型正电子体层扫描、微型单光子发射计算体层扫描、活体影像系统等分子显像设备亦在动物模型中尝试应用[9]。此种均有敏感、实时、无创的特点，便于临床推广，但其费用高昂，临床应用并不广泛。

3.2 荧光染色法

光学成像技术一般采用荧光染料法和荧光素酶生物发光，Defrère等[10]的实验结果证实了经体外荧光量化观测方案的可行性，该法实现了对异位病灶的连续性观察，使EMs动态活体研究成为可能。荧光模型的优势明显：①主观影响小，对病灶敏感，定位精确，在对表面不典型病灶的观察上得到更好的体现；②病灶重量和荧光强度呈正相关；③不影响移植的内膜生物特性，且某些荧光表达不因时间延长而衰减。

近年标记方法不断得到改进，根据其荧光产生机制和来源的不同分为[11]：①荧光染料直接标识内膜。②基因转染：利用病毒载体（如慢病毒）将荧光蛋白基因或荧光素酶基因转入内膜细胞，从而发出荧光。③荧光转基因动物在体内膜移植。相较而言，前两类可避免物种差异导致的结果偏差。然而，随着荧光模型的不断深入研究，如何提高标记蛋白的表达，提升转染穿透力，观测表达时间及组织特异性须深入探索。此外，检测系统（三维成像系统和定量测定）也有待进一步完善。

4 机制与应用

根据2015年EMs最新诊治指南，其治疗方法可分为手术治疗、药物治疗、介人治疗、中药治疗及辅助治疗（如辅助生殖技术治疗）等。EMs首选手术治疗，但复发率高，即便是根治性手术，也存在复发风险。药物治疗便是攻克EMs的研究重点。目前EMs的发病机制尚不明确，各种药物都有不同程度的不良反应，且仍有较高的复发率。因此，了解EMs发病机制，开发新药势在必行。

EMs发病机制相关的学说有子宫内膜种植学说、在位内膜学说、体腔上皮化生学说、干细胞学说、遗传学说、免疫学说等[12]。最先提出的是“经血逆流种植学说”，但近来流调显示：育龄妇女多有经血逆流的现象，但只有小部分发展为EMs。因此，EMs的发生没有得到完美的解释。1980年Weed等[13]提出EMs和机体免疫相关，至今已有更多证据表明免疫及炎症因素发挥重要作用[14-15]，因此，免疫调节治疗EMs日益得到关注。但目前免疫调节治疗的临床研究还十分缺乏。临床研究证实了己酮可可碱缓解盆腔疼痛、提高妊娠率的重要作用；抗TNF-α治疗、增强NK细胞活性药物以及中药的免疫调节治疗的效果及安全性有待更多临床研究证实，此类药物的不良反应有待探讨，妊娠安全性也有待评估。近年来，干细胞起源学说备受关注，学者们通过实验证明了内膜中干细胞的存在，认为干细胞脱落、增殖、分化是内异症发生的重要原因[16]，这也为EMs机制研究及药物治疗提供了新的思路。

郎景和“在位内膜决定论”中提出：EMs发病的两大基石——遗传和免疫[17]。子宫内膜细胞的“类肿瘤”的生物学行为使其逃避机体免疫系统的识别与攻击并继续生长，启发思考：内异症作为一种“良性癌”是否存在与肿瘤细胞一样的免疫逃逸机制？

许多学者研究发现许多肿瘤发生发展的调节信号通路也参与了对EMs恶性生物学行为的调控[18]，Foxp3、Fas及FasL蛋白等与免疫逃逸相关的因子在妇科疾病中存在异常表达。研究表明，抑制Foxp3表达可有效提高机体肿瘤免疫能力。国内外学者发现，异位症的内膜组织不论在位还是异位，均有对抗Fas途径介导凋亡的潜能[19]，这为研究EMs的发病机制和治疗方法提供了更广阔的思路：异位组织局部浸润Foxp3是否能改善患者症状及预后？是否可以通过切断相关负性信号调节通路，阻断异位内膜的免疫逃逸而达到治疗作用？

5 新型特殊模型的建立

5.1 人免疫功能重建EMs动物模型

EMs发病机制复杂，免疫机制已成为研究热点。自体移植在组织学特性和生物反应上与人类存在一定的差异，而传统异体移植使用免疫缺陷小鼠，限制了EMs免疫学机制的研究。20世纪末Somigliana等[20]成功建立了有免疫力小鼠的内异症模型，虽发病机制与人类相近，但3次手术创伤，小鼠易死，难以观察，且病灶小，测量误差大。王群华等[21]率先建立了具有人免疫功能的鼠EMs模型。采用早孕人蜕膜和其脐血单个核细胞联合移植，移植后仍保持原有组织形态，性状稳定。建立EMs人源化裸鼠模型的同时，给予人源化EMs裸鼠同源的自体外周血来源的人免疫细胞，建立含有人免疫系统的人源化裸鼠EMs模型，有重要的临床参考意义。

5.2 复发型EMs模型

研究显示：EMs保守性手术后1、2、5年的累计复发率分别在10%、20%、50%左右[22]。至今复发仍是临床亟需解决但又非常棘手的问题，所以建立EMs复发动物模型，探讨EMs复发的机制是必要的。黄洁明等[23]通过手术切除原有异位病灶，建立复发型EMs大鼠模型。发现手术只是破坏或缩小了病灶，对局部雌激素的合成没有干扰，其微环境依旧存在，残留的内膜细胞仍具再生長的潜能，这也许是EMs术后高复发率的根本原因之一。同时，杨艳环等[24]通过实验验证复发模型建立的可行性。

5.3 中医病证结合动物模型

中医药在治疗EMs上有独到之处，临床应用取得了一定的经验，中医治疗能明显改善症状，增加受孕机会，减少复发，并且调节全身免疫功能[25-26]，且通过部分实验证实了其具有确切的疗效[27]。但作用机制处于探索阶段，研究仅停留在对某些因子的影响上，缺乏更深层次的研究，未揭示其确切的治疗机制，且临床上中医证型会随时间推移呈现复杂的证型演变，在证候的标准化、规范化方面以及方药与病证的相关性方面，仍然缺乏深入的基础研究作为理论支撑。我们必须引入病证结合的动物模型，研究其宏观表征、微观指标以及与方药的对应关系，使证候的研究向标准化、客观化方向发展。

5.4 体外三维模型

体外三维模型最初运用于肿瘤学的研究，相较于传统的二维模型，三维模型引入了细胞外基质，构建了多方位细胞生长的微环境，能更好地观察细胞的侵袭性。Matthews等[28]经实验证实异位内膜细胞经体外培养，维持了基本形态，且其生化活性与在位内膜相似。Tsuno等[29]建立的体外EMs基质细胞培养模型，为研究内膜细胞与基质细胞间的相互作用机制提供了更好的平台。Mehasseb等[30]通过体外三维模型的建立，发现子宫肌层细胞影响着基质细胞浸润的深度，提示EMs的发病与子宫肌层也许相关。建立EMs体外细胞模型有利于维持内膜细胞的生物学特性，更好地模拟致病的微环境，观察细胞生长，探讨比较腺上皮细胞及间质细胞不同特性及相互作用。此外，EMs体外细胞模型为观察药物疗效、研究药理提供了有效手段。但体外模型对于EMs远处转移特性的观察存在局限性，如何提高模型稳定性、延长细胞生存时间也值得进一步探索。

6 小结

本文希望通过对建模方法的探讨，逐步完善动物模型，使之更加贴合实验及临床研究的需要。希望以动物模型为平台，深入了解EMs发病的免疫机制，了解肿瘤免疫逃逸相关因子如Foxp3、Fas-FasL通路等的作用，开发免疫治疗新药，探寻中药免疫作用机制，实现多方面、多角度的中西医结合治疗，以期为EMs患者提供规范化、标準化的诊治方案，全面提高中西医结合治疗EMs的水平。

[参考文献]

[1] 中华医学会妇产科学分会子宫内膜异位症协作组.子宫内膜异位症的诊治指南[J].中华妇产科杂志，2015，50（3）：161-169.

[2] 孙俊杰，马洪达，宋洁，等.人子宫内膜异位症裸鼠模型的建立[J].中国实验动物学报，2009，17（4）：296-298， 328.

[3] Nisolle M，Casanas-Roux F，Marbaix E，et al. Transplantation of cultured explants of human endometrium into nude mice [J]. Human Reproduction，2000，15（3）：572-577.

[4] 许艳丽，杨卓，陈英汉，等.人子宫内膜异位症在位内膜间质细胞原代培养方法探讨[J].中国全科医学，2009，12（9B）：1669-1672.

[5] 郎景和.关于子宫内膜异位症的再认识及其意义[J].中国工程科学，2009，10（11）：137-142.

[6] 朱启江.在位及异位子宫内膜组织建立子宫内膜异位症动物模型的研究[J].淮海医药，2010，28（4）：290-292.

[7] Banu SK，Starzinski-Powitz A，Speights VO，et al. Induction of peritoneal endometriosis in nude mice with use of human immortalized endometriosis epithelial and stromal cells：a potential experimental tool to study molecular pathogenesis of endometriosis in humans [J]. Fertil Steril，2009，91（5 Suppl）：2199-2209.

[8] Van Langendonckt A，Casanas-Roux F，Eggermont J，et al. Characterization of iron deposition in endometriotic lesion induced in the nude mouse model [J]. Hum Reprod，2004， 19（6）：1265-1271.

[9] 刘斌，王宁宁.子宫内膜异位症动物模型活体无创观察研究[J].国际妇产科学杂志，2009，36（6）：472-475.

[10] Defrère S，Van Langendonckt A，González Ramos R，et al. Quantification of endometriotic lesions in a murine model by fluorimetric and morphometric analyses [J]. Hum Reprod，2005，21（3）：810-817.

[11] Liu B，Wang NN，Wang ZL，et al. Improved nude mouse models for green fluorescence human endometriosis [J]. J Obstet Gynaecol Res，2010，36（6）：1214-1221.

[12] 薛霁，刘丽敏.子宫内膜异位症免疫功能的变化及中医学认识[J].中国妇幼保健，2011，26（25）：3998-3999.

[13] Weed JC，Arquembourg PC. Endometriosis：can it produce an autoimmune response resulting in infertility？ [J]. Clinical Obstetrics and Gynecology，1980，23（3）：885.

[14] Ceyhan ST，Onguru O，Fidan U，et al. Comparison of aromatase inhibitor（letrozole）and immunomodulators（infliximab and etanercept）on the regression of endometriotic implants in a rat model [J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2010，154（1）：100-104.

[15] Khoufache K，Michaud N，Harir N，et al. Anomalies in the inflammatory response in endometriosis and possible consequences：a review [J]. Minerva Endocrinologica，2012，37（1）：75-92.

[16] 于聪祥，宋静慧.干细胞在子宫内膜异位症发病中的意义[J].国际妇产科学杂志，2013，40（1）：27-30.

[17] 仝佳丽，郎景和.子宫内膜异位症的在位内膜病变研究进展[J].现代妇产科进展，2010，19（6）：465-467.

[18] 涂飞霞，阮菲，吴瑞瑾，等.STAT3和SOCS3与子宫内膜异位症的相关性研究[J].中国病理生理杂志，2012， 28（1）：152-154，158.

[19] 刘洪正，王玉亮.子宫内膜异位症患者腹腔液单个核细胞Fas的表达及意义[J].检验医学，2015，30（5）：454-456.

[20] Somigliana E，Viganò P，Rossi G，et al. Endometrial ability to implant in ectopic sites can be prevented by interleukin-12 in a murine model of endometriosis [J]. Human Reproduction，1999，14（12）：2944-2950.

[21] 王群華，凌斌，赵卫东，等.人蜕膜移植建立NOD-SCID鼠子宫内膜异位症模型[J].安徽医科大学学报，2005， 40（2）：99-101.

[22] Selcuk I，Bozdag G. Recurrence of endometriosis；risk factors，mechanisms and biomarkers；review of the literature [J]. J Turk Ger Gynecol Assoc，2013，14（2）：98-103.

[23] 黄洁明，桑传兰，罗颂平.子宫内膜异位症复发模型的建立及中药干预的研究[J].中华中医药杂志，2012，27（4）：814-818.

[24] 杨艳环，赵瑞华，徐彩.活血消异方对子宫内膜异位症复发风险大鼠模型的影响[J].中华中医药杂志，2012， 27（7）：1911-1913.

[25] 崔阳阳，孙伟伟，赵瑞华.病证结合子宫内膜异位症动物模型探讨[J].中国中医药信息杂志，2014，21（11）：1-4.

[26] 应翩.中药分阶段治疗子宫内膜异位症临床研究[J].中华中医药学刊，2013，31（7）：1727-1728.

[27] 曹佃贵，蔡宇萍，陈颖异.中药治疗子宫内膜异位症的实验研究进展[J].中国中医药科技，2012，19（4）：381-382.

[28] Matthews CJ，Redfern CP，Hirst BH，et al. Characterization of human purified epithelial and stromal cells from endometrium and endometriosis in tissue culture [J]. Fertil Steril，1992，57（5）：990-997.

[29] Tsuno A，Nasu K，Kawano Y，et al. Fasudil inhibits the proliferation and contractility and induces cell cycle arrest and apoptosis of human endometriotic stromal cells：a promising agent for the treatment of endometriosis [J]. J Clin Endocrinol Metab，2011，96（12）：1944-1952.

[30] Mehasseb MK，Taylor AH，Pringle JH，et al. Enhanced invasion of stromal cells from adenomyosis in a three-dimensional coculture model is augmented by the presence of myocytes from affected uteri [J]. Fertil Steril，2010，94（7）：2547-2551.

（收稿日期：2015-11-12 本文编辑：张瑜杰）