新痹痛灵对CIA大鼠关节炎症及T细胞亚群的影响

刘晏 魏刚 陆兔林

[摘要] 目的 观察新痹痛灵对CIA大鼠脾脏T细胞亚群、白介素-2（IL-2）及白介素-2受体（IL-2R）的影响，探讨新痹痛灵治疗类风湿关节炎的作用机制。 方法 44只SD大鼠建立胶原诱导的关节炎模型（CIA），造模成功的36只大鼠随机分为4组： 模型组、阳性药组、新痹痛灵中剂量组、新痹痛灵高剂量组，每组各9只，另取9只正常SD大鼠为正常组。造模成功后连续给药28 d，末次给药后取血，运用流式细胞仪检测大鼠脾脏CD4+ T细胞及CD8+ T细胞的变化，ELISA检测观察大鼠脾脏IL-2、IL-2R。 结果 与模型组比较，新痹痛灵中剂量组、新痹痛灵高剂量组的CD4+/CD8+比值下调，IL-2与IL-2R水平下降，差异有统计学意义（P < 0.01或P < 0.05）。形态学观察显示：新痹痛灵对滑膜细胞增殖有抑制作用。 结论 新痹痛灵对T细胞亚群及其相关炎症因子的紊乱调节作用，可能是其治疗类风湿关节炎的机制之一。

[关键词] 新痹痛灵；CIA大鼠；T细胞亚群；IL-2；IL-2R

[中图分类号] R593 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）02（b）-0008-04

Effects of New Bitongling Compound on the T cell semi-group of CIA rats

LIU Yan1 WEI Gang2 LU Tulin3 GUO Haiying1 WANG Yue1

1.Nanjing University of Chinese Medicine， Jiangsu Province， Nanjing 210000， China； 2.Jiangsu Province Hospital of TCM， Jiangsu Province， Nanjing 210000， China；3.Nanjing University of Chinese Medicine， Jiangsu Province， Nanjing 210000， China

[Abstract] Objective To observe the effects of New Bitongling Compound on the T cell semi-group， IL-2 and IL-2R， and study the mechanism of New Bitongling Compound treating RA. Methods 44 SD rats were established collagen-induced arthritis （CIA） model， successful CIA 36 rats were randomly divided into 4 groups： model group， positive drug group， middle-dose New Bitongling Compound group， high-dose new Bitongling Compound group， with 9 rats in each group， 9 normal SD rats were as normal group. After model successfully established， the rats were given drugs for 28 d， blood sample was taken after the last administration. The CD4+ and CD8+ T cell in spleen of CIA rats were detected by flow cytometer， the IL-2 and IL-2R were detected by ELISA. Results Compared with model group， the CD4+/CD8+ ratio of middle-dose New Bitongling Compound group and high-dose New Bitongling Compound group decreased， the level of IL-2 and IL-2R also reduced， the differences were statistically significant （P < 0.01 or P < 0.05）. Morphological observation indicated that New Bitongling Compound had significant in-hibitory on synovial cells proliferation. Conclusion New Bitongling Compound can regulate the abnormal T cell semi-group IL-2 and IL-2R， which may be one of its mechanism of treatment of rheumatoid arthritis.

[Key words] New Bitongling Compound； CIA rats； T cell semi-group； IL-2；IL-2R

類风湿关节炎（RA）是一种以对称性多关节炎为主要表现的系统性、自身免疫性疾病，其基本病理改变是滑膜炎，病因研究至今尚无明确定论。研究表明，T细胞是RA关节滑膜中数量最多的一类炎症细胞，且处于激活状态，对RA病理的持续进展起重要作用[1]，而白介素2（IL-2）与白介素-2受体（IL-2R）是与T细胞密切相关的炎症因子，是反映机体细胞免疫功能的重要指标[2，3]。

新痹痛灵是从全国名老中医汪履秋教授治疗中医“痹证”（尤其是类风湿关节炎）的经验方变化而来，由朱丹溪上中下通用痛风方化裁，在结合了前期的实验及临床研究后总结而出。为进一步研究新痹痛灵治疗痹证的疗效和机制，本实验分别从T细胞亚群和炎症因子两个方面，对新痹痛灵进行了实验研究[4]。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 新痹痛灵浸膏制备 中药饮片购于江苏省中医院门诊部药房，浸膏制作程序由南京中医药大学中药炮制教研室研制，江苏省中医院制剂部加工而成。痹痛灵浸膏主要制备工艺：取桂枝等提取挥发油、麻黄等醇提、制川乌等水提，减压回收乙醇至无醇味的浸膏。取一定量浸膏烘干称其质量，计算浸膏得率为9.3%，即浸膏折合原药材为每1克浸膏含生药量10.75 g。

1.1.2 其他 雷公藤多苷片，浙江得恩德制药有限公司，生产批号1403111B；牛Ⅱ型胶原蛋白，美国Chondrex公司；完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂，美国Sigma公司；Anti-CD3-APC单抗，美国eBioscience公司，E16085-103；Anti-CD4-FITC单抗，美国eBioscience公司，E00074-1632；Anti-CD8-PE单抗，美国eBioscience公司，E01045-1643；红细胞裂解液，美国genscrip公司，C31141409；大鼠IL-2、IL-2R ELISA检测试剂盒，R&D公司。流式细胞仪，型号：FACS Calibur，BD公司；台式大容量高速离心机，型号：5810，Eppendortf公司；酶标仪，型号：EnVision，PerKin Elmer公司。

1.2 实验动物

健康SD雄性大鼠（180±20g），4周龄，北京维通利华实验动物技术有限公司；動物合格证号：SCXX（京）2012-0001。动物饲养在南京中医药大学SPF级动物房，实验开始前一周进行适应性饲养1周，温度（22±1）℃，湿度（55±5）%，12 h光暗循环。饲料和水均在消毒后由动物自由摄取。

1.3 方法

1.3.1 模型建立及给药 本实验共54只大鼠，10只大鼠不做任何处理为正常组，44只大鼠在适应性喂养1周后进行胶原诱导的关节炎模型（CIA）造模，无菌条件下将牛Ⅱ型胶原蛋白（CollagenⅡ，CⅡ）溶于0.05 mol/L乙酸溶液（浓度为2 mg/mL），置4℃冷库、避光摇荡过夜充分溶解后，再与等量弗氏完全佐剂充分混合（Ⅱ型胶原终浓度为1 mg/mL），于每只大鼠尾根部1～2 cm处按0.2 mL/只皮下注射；7 d后行加强免疫，取加强免疫乳胶混合物（将初次免疫中将完全佐剂换成不完全佐剂），按0.1 mL/只于尾根部1～2 cm处皮内注射，其余操作同初次免疫，造模共21 d。以AI值>2为造模成功，44只大鼠中36只CIA造模成功，造模成功率为81.8%。36只大鼠随机分为4组，每组各9只大鼠，即模型组：给予等量蒸馏水；阳性药组：雷公藤多苷片溶液0.012 g/kg；新痹痛灵中剂量治疗组：给予3.95 g/kg；新痹痛灵高剂量治疗组：给予15.8 g/kg；另取9只正常组大鼠给予等量蒸馏水；各组于造模成功后给药，每日1次，连续28 d[5-7]。

1.3.2 大鼠的一般情况及AI的计算 体重（g）分组前及用药前各1次、用药后每周测1次；全身整体状况观察包括大鼠形体、毛色、反应、活动情况、食欲、大小便。于初次免疫前1 d，初次免疫后每周用肉眼观察，依据关节肿大、变形、颜色及关节活动情况对大鼠足趾关节炎症进行评分，肉眼观察AI值>2分说明CIA大鼠造模成功。具体评分标准参考文献[8]方法，无关节肿大为0分；有红色斑点和轻度肿胀为1分；关节中度肿胀为2分；关节严重肿胀为3分；关节严重肿胀且不能负重为4分。

1.3.3 脾脏T细胞亚群及细胞因子的检测 各组大鼠于末次给药24 h后股动脉放血处死，取胸腺、脾脏，去除脏器表面游离组织、被膜，用生理盐水冲干净，用眼科剪将脾脏剪碎后，加入3 mL生理盐水，用一个覆盖300目尼龙网的烧杯过滤至锥形管内，即得脾脏单个细胞悬液。取1 mL的脾脏淋巴细胞悬液于离心管中，在室温下以1500 r/min，离心4 min，取出后倾倒上清（勿破坏下面的沉淀）加入抗体，涡旋后，避光孵育15 min，脾脏组加入1 mL的红细胞裂解液原液，避光孵育10 min。以1500 r/min，离心4 min，去上清，加PBS缓冲液500 μL，吹打后用涡旋机涡旋，再次在室温下以1500 r/min，离心4 min，去上清，加500 μL的PBS缓冲液，使用流式细胞仪检测。将另一部分脾脏放入液氮中冻存，按试剂盒说明书以ELISA法测定脾脏IL-2、IL-2R，依次稀释标准品；加样、孵育；加酶、孵育；加显色剂；测定各个标本的吸光度（OD值）。

1.3.4 组织形态学观察 心脏采血后脱颈处死后取右侧踝关节剔除皮毛、肌肉、筋膜等，将保留完整的踝关节和滑膜组织固定于4%多聚甲醛固定液中1周[9]。关节病理制作及形态学检测参考文献[9]方法，依次脱钙、固定标本、制作标本蜡块、切片、然后进行HE染色、最后拍照保存进行病理评分。病理学评分参照文献[10]方法，具体评分标准如下：关节组织病理学评分标准如下：0分：没有组织病理学改变；1分：轻微局灶性浸润；2分：中度浸润；3分：严重炎症浸润，但无血管翳形成或软骨损伤；4分：非常严重的浸润形成血管翳和/或软骨、骨侵蚀。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行数据资料的统计分析。正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况的评估及模型的鉴定

第2次免疫后1周左右，大鼠陆续发病，表现为足趾肿胀，至21 d左右，36只大鼠（81.8%）达到急性炎症期表现：关节肿胀明显。症状一般自后踝先发，逐渐加重，累及趾间关节、前足等，严重者四肢肿胀不能承重、活动受限。肉眼观察大鼠AI值>2，造模成功。

2.2 新痹痛灵对T细胞亚群的影响

造模后模型组CD4+数值显著升高（P < 0.05），致使CD4+/CD8+比值上升（P < 0.05）；予给药干预后，CD4+、CD4+/CD8+均有不同程度回降（P < 0.05）；但CD8+数值并未见规律性改变，可见CD4+数值在最终结果中占决定性地位。见表1、图1～2。

表1 新痹痛灵对T细胞亚群的影响（n = 9，x±s）

注：与模型组相比，*P < 0.05

图1 正常组大鼠CD4+ T细胞流式图

2.3 新痹痛灵对脾脏IL-2、IL-2R的影响

造模后大鼠脾脏IL-2与IL-2R均有显著上升（P < 0.01），予给药干预后，均有不同程度回落，其中阳性药组药效最为显著，新痹痛灵高剂量组其次，新痹痛灵中剂量组最末。见表2。

表2 新痹痛灵对脾脏IL-2、IL-2R的影响（n = 9，x±s）

注：与模型组比较，*P < 0.01， **P < 0.05

2.4 病理形态学观察

对比各组病理切片，正常组（图3）关节及滑膜结构正常，关节软骨表面光滑平整，无炎细胞及淋巴细胞浸润现象，无血管翳形成。模型组（图4）见明显滑膜、软骨坏死，阳性药组（图5）、新痹痛灵中剂量组（图6）出现滑膜、软骨破坏，炎性细胞浸润，但较模型组有明显改善。

正常组大鼠关节表面被覆透明软骨，关节囊腔光滑，关节滑膜细胞连续平整、结构层次清晰，未见滑膜肿胀、组织坏死、炎细胞浸润

图3 正常组大鼠关节病理（HE染色，400×）

图4 模型组大鼠关节病理（HE染色，400×）

图5 阳性药组大鼠关节病理（HE染色，400×）

图6 新痹痛灵中剂量组大鼠关节病理（HE染色，400×）

3 讨论

RA是一种以大量T细胞浸潤为主的慢性滑膜炎为特征的自身免疫性疾病，其发病机制与T细胞亚群数量和功能有密切关系[11]。

本实验结果显示，T细胞流式实验中，CIA模型大鼠脾脏CD4+T细胞明显升高（P < 0.01），而CD8+T细胞无明显增长或下降规律，但最终模型组CD4+/CD8+比值较空白组升高（P < 0.05），说明T细胞在类风湿关节炎的发病过程中其重要作用。而在阳性药和新痹痛灵治疗后，脾脏组织中CD4+ T细胞与CD4+/CD8+比值均有回降（P < 0.05）。同时，在IL-2及IL-2R实验中，模型组IL-2的数值明显升高（P < 0.01），予阳性药（雷公藤多苷）及新痹痛灵治疗后，脾脏中IL-2有不同程度的下降，阳性药组和新痹痛灵对脾脏IL-2均由回调作用，但从实验数值上可以看出，阳性药组药效最强（P < 0.01），对新痹痛灵有剂量依赖性。

既往研究表明，CD4是T辅助/诱导细胞的表面标志，CD4+ T细胞具有辅助T细胞转变成效应细胞、B细胞转化成浆细胞以及活化巨噬细胞等功能[12-14]。CD8是T抑制/杀伤细胞的表面标志，CD8+ T细胞具有细胞毒效应及抑制T细胞活化、抑制B细胞产生抗体，起抑制细胞及体液免疫的作用，因此，CD4+、CD8+数目的变化，尤其CD4+/CD8+比值是RA发病及免疫损伤的中心环节[15]。IL-2主要是由外周免疫器官（如脾脏、淋巴结等）的CD4+辅助细胞产生，同时也具有刺激T细胞增殖的能力，IL-2起的是受体间的相互作用。各种细胞表面有与IL-2结合的蛋白，称为IL-2R[3，16]。而可被释放和溶解的IL-2R，称为可溶性白介素-2受体（sIL-2R），大剂量IL-2输入体内能引起血清sIL-2R浓度的增高[17，2]。本实验中，CIA大鼠脾脏CD4+升高，CD4+/CD8+比值、IL-2、sIL-2R均上升，提示Th细胞功能相对亢进和Ts细胞功能相对减弱。表明，新痹痛灵可能通过抑制Th细胞功能亢进，并增强Ts细胞功能，对类风湿关节炎起到治疗作用。

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（收稿日期：2015-08-27 本文编辑：苏 畅）