四种柱花草种子萌发过程中参与糖代谢的酶活性变化研究

张瑜 严琳玲 虞道耿 杨虎彪 罗小燕 白昌军

摘要：本研究通过测定柱花草4个品种在种子萌发过程中参与糖代谢的α-淀粉酶、β-淀粉酶和总淀粉酶活性的动态变化，得出α-淀粉酶活性在种子萌发和幼芽生长初期活性增加，在萌发中期和幼芽生长中后期酶活性降低，其中马弓形柱花草变化幅度最大。β-淀粉酶活性在萌发期呈上升趋势，到种子开始露白即胚根突破种皮时达到最大值，到幼芽生长期β-淀粉酶活性降低。其中维诺拉有钩柱花草在不同时期的β-淀粉酶活性最低。以热研2号柱花草参与糖代谢的淀粉酶活性进行相关分析的结果表明，α-淀粉酶和总淀粉酶之间的相关性比β-淀粉酶的显著，所以α-淀粉酶活性变化能够更好地反映总淀粉酶活性的变化。可为研究柱花草种子萌发中的生理变化提供参考依据。

关键词：柱花草；种子萌发；糖代谢；酶活性

中图分类号：S543.093 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）05-1227-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.05.035

Study on the Changes of Enzyme Activity Involved in the Glucose Metabolism of Four Kinds of Stylo Seed Germination

ZHANG Yu， YAN Lin-ling， YU Dao-geng， YANG Hu-biao， LUO Xiao-yan， BAI Chang-jun

（Tropical Crops Genetic Resources Institute，CATAS/Ministry of Agriculture Key Laboratory for Utilization of Tropical Crops Germplasm Resources，Danzhou 571737，Hainan，China）

Abstract： In this paper， the activity of α-amylase， β-amylase and the total amylase enzyme which involved in glucose metabolism during seed germination of four Stylo species were tested and analyzed. The results showed that the activity of α- amylase enzyme increased in the early stage of seed germination and bud growth， and decreased in the middle period of seed germination and bud growth in the late， in which the variation in the Fine stem Stylo was the largest. The activity of β-amylase enzyme presented increasing trend in germination stage， and reached the maximum value when the seeds began to emerge white which means the radicle break through seed coat， and decreasedin the period of bud growth. The activity of β-amylase enzyme was the lowest in different periods of Verano Stylo. Taking Reyan NO.2 Stylo as example， the correlation analysis showed that the correlation between α-amylase and the total amylase was more significant than β-amylase， so the changes of α-amylase enzyme activity could better reflect the changes of total amylase enzyme activity. It provided a reference for the study on physiological changes of Stylo during seeds germination.

Key words：stylo；seed germination；glucose metabolism；enzyme activity

豆科植物的種子不仅含有丰富的碳水化合物，淀粉含量也较高，包括直链淀粉和支链淀粉[1，2]。淀粉在淀粉酶等水解酶作用下分解为简单的可溶性糖，为种子萌发提供充分的能量和物质准备[3]。淀粉酶分为α-淀粉酶和β-淀粉酶[4]。α-淀粉酶在种子中是以结合态存在，底物为直链淀粉。β-淀粉酶作用底物为支链淀粉[5，6]。

柱花草[Stylo guianensis （Aubl） SW.]为豆科（Leguminosae）柱花草属（Stylosanthes Sw.）植物，是中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所在20世纪80年代从国外引进，已从中选育出了一批优良的豆科牧草新品种[7-9]。柱花草性喜湿热，适生于中国热带、南亚热带地区，目前在海南、广东、广西等省区的推广面积约54万hm2。它是一种多功能、多效益的作物，可与农、林、畜牧业紧密结合，互相促进，产生良好的经济效益、社会效益和生态效益[10-12]。目前关于柱花草的研究主要集中于品种选育、高产栽培技术、种子生产技术、营养品质、抗性、饲料开发以及遗传多样性研究等方面[13-20]，对种子的研究主要在破除硬实，包括一些机械处理、热水处理、高温干燥处理、酸碱处理等对柱花草硬实种子发芽的影响，以及提高发芽方法上，包括赤霉素、超声波对提高种子发芽率的影响，少量的保存技术研究方面[21-25]。对柱花草种子萌发的营养代谢研究是一个全新的领域，它对了解种子内部生理功能，揭示柱花草种子萌发的代谢机理有很高的研究价值。

1 材料与方法

1.1 材料来源

试验所用柱花草种子采集自中国热带农业科学院儋州院区牧草基地，为以下4种柱花草品种：热研2号柱花草（S. guianensis SW. cv. Reyan No.2）、维拉诺有钩柱花草[S. hamata （L.）Taub.cv. Verano]、西卡柱花草（S. scabra Vog cv.Seca）和马弓形柱花草（S. hippocampoides Fine stem stylo）。

1.2 方法

选取饱满健康、大小一致的种子进行发芽试验。种子用80 ℃热水浸泡3～5 min后取出冷却，将处理后的种子放置于铺有2层滤纸的培养皿中，于恒温培养箱（25 ℃、每天光照12 h、1 600 lx）中发芽，每隔2 d喷1次水保持滤纸的湿润。

1.3 样品制备

选取4种柱花草种子6种萌发状态下的胚乳为样品，并记录每种萌发状态下的种子长度、幼芽长（表1），装入相对应的密封塑料袋中，贴好标签，放入-80 ℃的超低温冰箱中保存备用。

1.4 仪器设备

高速带温控离心机（TGL20M上海赵迪）、恒温培养箱（BPH-9272上海一恒）、数显恒温水浴锅（HH-S6江苏诺基）、离心机（L-550湖南湘仪）、可见光分光光度计（N4上海仪电）、-80 ℃立式超低温冰箱（DW-HL669中科美菱）。

1.5 测定项目

利用3，5-二硝基水杨酸方法（DNS）测定总淀粉酶活性、α-淀粉酶活性及β-淀粉酶活性[26]。

1.6 数据分析

试验数据用Excel进行制图和分析。

2 结果与分析

2.1 α-淀粉酶活性變化

由图1可知，未经过发芽处理的柱花草种子α-淀粉酶活性最低，4个品种中马弓形柱花草酶活性较其他3个草种低。当种子开始萌发后酶活性呈上升趋势，4个草种的α-淀粉酶活性均有增加，是未处理种子酶活性的1.2～1.4倍。随后当种子露白时4个草种的α-淀粉酶活性降低，马弓形柱花草降低幅度最大为13.9%；当胚根露出种皮后，幼芽开始生长，淀粉酶活性上升达到最大值，是未处理种子酶活性的1.3～1.6倍。到萌发后期α-淀粉酶活性缓慢降低。分析可知，在4种柱花草种子萌发期间，α-淀粉酶的活性呈由低到高到低到高再到低的曲线变化，其中马弓形柱花草变化幅度最大。这可能是由于种子萌发初期淀粉大量分解，α-淀粉酶活性升高，而幼芽生长后α-淀粉酶的作用底物减少酶活性降低。

2.2 β-淀粉酶活性变化

4种柱花草种子在未经发芽处理和催芽处理后β-淀粉酶活性几乎没有太大变化，可能这个阶段是大分子化合物在α-淀粉酶催化分解为小分子碳水化合物，β-淀粉酶活性变化不明显（图2）。种子开始萌发后，β-淀粉酶活性开始增加，到种子开始露白即胚根突破种皮时达到最大值，比未经发芽处理种子的酶活性增加了24%～35%，其中马弓形柱花草增加幅度最低，热研2号柱花草略高于其他。到萌发后期，β-淀粉酶活性降低后又稍有增加。结果说明幼芽生长中期对支链淀粉的降解有所缓解，酶活性下降。酶活性后又增加，这可能是因为到幼芽生长后期，胚乳中的直链淀粉减少，提供小分子碳水化合物的主要是支链淀粉的降解，故β-淀粉酶活性在后期又增加。在4个品种种子的萌发过程中，维诺拉有钩柱花草在不同萌发时期的β-淀粉酶活性最低。

2.3 总淀粉酶活性的变化

由图3可知，在种子萌发初期总淀粉酶活性呈上升趋势，缓慢增加。到萌发中期，总淀粉酶活性略微降低。到了萌发后期，幼芽开始生长，淀粉酶活性上升达到最大值，是未处理种子酶活性的1.2倍。其中西卡柱花草的总淀粉酶活性变化幅度最大。在柱花草种子萌发期间，淀粉降解程度在不同时期不相同。萌发初期淀粉降解较快，在萌发中期淀粉降解速度减缓，随着幼芽的生长发育代谢加大，淀粉酶大量合成，淀粉进入快速降解阶段。

2.4 各酶之间酶活性比较分析

以热研2号柱花草参与糖代谢的淀粉酶活性进行相关分析，如图4所示，总淀粉酶活性和α-淀粉酶活性关系的回归方程：y=-2.073 0x2+5.772 3x+2.434 2，x是α-淀粉酶活性，y是总淀粉酶活性，二者之间有显著的相关关系（R2=0.549 4）。总淀粉酶活性和β-淀粉酶活性关系的回归方程：y=-1.579 9x2+4.106 3x+1.077 3，二者有显著的相关关系（R2=0.334 6）。在热研2号柱花草种子萌发过程中α-淀粉酶活性总体比β-淀粉酶活性高，而且它和总淀粉酶之间的相关性比β-淀粉酶的显著，所以α-淀粉酶活性变化能够更好地反映总淀粉酶活性的变化。

3 小结与讨论

1）α-淀粉酶在种子萌发初期和幼芽生长初期活性增加，在萌发中期和幼芽生长中后期酶活性降低，其中马弓形柱花草变化幅度最大。这可能是由于种子萌发初期淀粉大量分解，α-淀粉酶活性升高，而幼芽生长后α-淀粉酶的作用底物减少酶活性降低。在种子萌发早期，大分子化合物是在a-淀粉酶催化分解为小分子碳水化合物，β-淀粉酶活性在该时期变化不明显。到种子开始露白即胚根突破种皮时，主要是支链淀粉进行水解生成单糖，供给幼芽的生长发育，因此β-淀粉酶活性达到最大值。到幼芽生长期β-淀粉酶活性降低，可能是因为在幼芽生长期对支链淀粉的降解有所缓解，酶活性下降。其中维诺拉有钩柱花草在不同时期的β-淀粉酶活性最低。柱花草种子中α-淀粉酶和β-淀粉酶活性的变化规律正好相反，交替着对淀粉进行催化降解。

2）柱花草种子萌发过程中降解淀粉的酶主要是α-淀粉酶，它的活性总体都比β-淀粉酶活性高，说明柱花草种子胚乳中的淀粉主要是直链淀粉，或者支链淀粉的降解不及直链淀粉，提供糖类营养物质的主要是直链淀粉。以热研2号柱花草参与糖代谢的淀粉酶活性进行相关分析的结果说明，α-淀粉酶活性和总淀粉酶之间的相关性比β-淀粉酶的显著，所以α-淀粉酶活性变化能够更好地反映总淀粉酶活性的变化。

参考文献：

[1] 孟祥勋.大豆种子贮藏蛋白研究[J].东北农业大学学报，1997，28（2）：201-207.

[2] 石建斌，侯万伟，刘玉皎.蚕豆种子贮藏蛋白质组分的比较研究[J].植物遗传资源学报，2012，13（2）：304-307

[3] 程昕昕，周 毅，刘 正.甜玉米种子萌发过程中糖类物质转化动态变化分析[J].种子，2013，32（3）：10-13，

[4] 陶嘉龄，郑光华.种子活力[M].北京：科学出版社，1991.

[5] 孔 芳，蒋金金，吴 磊，等.芸蓑属种子贮藏蛋白质组分的比较研究[J].中国油料作物学报，2010，32（1）：20-24.

[6] NYKIFORUK C L，ANNE M. Storage reserve mobilization during low temperature germination and early seedling growth in Brassica napus[J].Plant Physiol Biochemical，1999，37（12）：939-947.

[7] 白昌军，刘国道，陈志权，等.热研20号太空柱花草选育研究报告[J].热带作物学报，2011，32（1）：33-41.

[8] 白昌军，刘国道，王东劲，等.西卡柱花草选育及其利用评价[J].草地学报，2004，12（3）：170-175.

[9] 白昌军，刘国道，严琳玲，等.热研18号柱花草选育及利用[J].草地学报，2011，19（1）：147-165.

[10] 张宣宣，黄佑谊，邱质华，等.柱花草生产、加工与开发利用技术研究[J].热带农业工程，2011（1）：4-7.

[11] 任 莉，易克贤，陈河龙，等.热带豆科牧草柱花草对泌乳奶牛产奶性能的影响[J].飼料工业，2011（13）：54-57.

[12] 龙会英，何华玄，张 德，等.干热河谷退化山地柱花草品种（系）比较试验[J].草业学报，2011，20（6）：230-236.

[13] 郇树乾，白昌军，王志勇.不同添加剂对热研二号柱花草青贮品质的影响[J].广东农业科学，2011（16）：82-84.

[14] 黄冬芬，王 朋，文 稀.4份柱花草耐铝胁迫的差异[J].热带作物学报，2012，33（1）：15-19.

[16] 戚春林，胡耀华.柱花草高产栽培综合农艺措施的研究[J].草业科学，2000，17（4）：33-38.

[17] 任 莉，易克贤，陈河龙.热带豆科牧草柱花草对泌乳奶牛产奶性能的影响[J].饲料工业，2011，32（13）：54-57.

[18] 唐燕琼，李瑞梅，符少萍.柱花草种质植物学特征比较分析[J].江西农业大学学报，2011，33（4）：629-635.

[19] 张宣宣，黄佑谊，邱质华.柱花草生产、加工与开发利用技术研究[J].热带农业工程，2011，35（1）：4-7.

[20] 张劲松，刘国道，郭振飞.柱花草编码CP12蛋白的cDNA克隆及其序列分析[J].热带作物学报，2011，32（6）：1102-1105.

[21] 张 莹，刘金祥，张德罡.赤霉素对柱花草种子萌发的影响[J].草原与草坪，2013，33（2）：21-25.

[22] 刘 壮，郇树乾，刘国道.不同处理对西卡柱花草硬实种子发芽的影响[J].热带农业科学，2008，28（5）：42-45.

[23] 邹冬梅.超干贮藏对柱花草种子的影响[J].热带作物学报，2005，26（3）：30-33.

[24] 邹冬梅.柱花草种子超干保存效果及其对膜系统的影响[J].草地学报，2005，13（1）：23-26.

[25] 庄南生，王 英，唐燕琼，等.超声波处理柱花草种子的生物学效应研究[J].草业科学，2006，23（3）：80-82.

[26] 张立军，樊金娟.植物生理学实验教程[M].北京：中国农业大学出版社，2007.