链脲佐菌素诱导糖尿病小鼠模型的心得体会

郑国亚 齐佳 刘顺梅 连波 陈丽梅 尹金良

[摘要] 链脲佐菌素是最常用的诱导动物发生糖尿病的药物。利用链脲佐菌素构建小鼠糖尿病模型的文献报道很多，但关于链脲佐菌素有效诱导小鼠糖尿病模型的关键因素及实验注意事项的报道却很少。本文总结了笔者在多次糖尿病小鼠建模实验中获得的一些经验与体会，以期为其他研究者开展糖尿病建模工作提供参考与指导作用。

[关键词] 链脲佐菌素；糖尿病；小鼠；模型

[中图分类号] R587.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）02（c）-0182-04

Experience on the construction of diabetic mice model induced by streptozotocin

ZHENG Guoya QI Jia LIU Shunmei LIAN Bo CHEN Limei YIN Jinliang

School of Bioscience and Technology， Weifang Medical College， Shandong Province， Weifang 261053， China

[Abstract] Streptozotocin （STZ） is the most widely used drug to produce animal model of diabetes mellitus. Many studies have been reported on the construction of STZ-induced diabetic mice model， but only scanty information is available on the detailed description of the key factors and details that should be pay attention to during establishment of the model. This paper summarizes the experiences of authors obtains from several times of producing diabetic mice model. The aim is to provide reference and instruction for other researchers.

[Key words] Sreptozotocin； Diabetes； Mice； Model

糖尿病是一种由多种因素引起的慢性非传染性代谢性疾病[1]，其发病机制是由T细胞介导的胰岛β细胞功能破坏而引起的自身免疫性疾病[2-3]，造成体内胰岛素缺乏，或胰岛素的利用率降低，导致机体对葡萄糖、蛋白和脂肪的代谢紊乱，出现明显的高血糖症，并伴有广泛而严重的并发症[4-6]。糖尿病的发病率较高，已成为一种全球性疾病，严重威胁着人类健康。据国际糖尿病联合会估算，到2030年，全世界糖尿病患者将由2010年的2.85亿例上升至4.38亿例[7]。目前对糖尿病的相关研究已成为世界范围内的一个重要课题。为了克服人体的局限性，建立稳定可靠的糖尿病动物模型越来越引起人们的关注[8]。制备糖尿病动物模型的方法较多，通过手术、药物或食物诱导、自发、转基因等都可诱发糖尿病[9-10]。由于自发和转基因费用昂贵，药物诱导法已成为目前构建糖尿病动物模型最常用的方法，主要诱导药物包括四氧嘧啶（alloxan，ALX）和链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）[11]。与ALX相比，STZ对实验动物的胰岛β细胞具有高度选择性，药物用量少，毒性小[12]。因此，STZ已成为目前最常用的糖尿病诱导药物[13]。利用STZ诱导糖尿病小鼠模型的文献较多，但对模型建立过程中的关键因素及一些细节和注意事项的完整阐述却很少。因此，本文将笔者在多次STZ诱导小鼠糖尿病模型过程中获得的一些经验及心得体会进行总结，以期为相关的研究者提供借鉴作用。

1 动物种类和品系的选择

适于用STZ诱导建立糖尿病模型的动物种类较多，如大鼠、小鼠、狗、猴等，兔也可以利用STZ建模，但对STZ的敏感性不如前面几种动物高。目前最常用于糖尿病建模的动物是大鼠和小鼠[13]。由于大鼠对STZ具有高敏感性，为避免造成大鼠死亡率高、成模率低等问题，需严格控制用药剂量。小鼠对STZ的敏感性较大鼠差，用小鼠代替大鼠，可增加对STZ剂量的耐受力，减少死亡率，并可以降低糖尿病动物模型制备的成本[14]。

不同动物对STZ的敏感性不同，同一种动物的不同品系对STZ的敏感性也有差异[9，15-16]，因此在建模时要适当选择动物种类和品系。就小鼠来说，最常用于糖尿病建模的C57BL/6J小鼠对STZ比较敏感，其敏感性高于FVB/NJ、BALB/C和A/J品系，但比CBA/J的敏感性低[9]。劉长清等[15]的研究发现，C57BL/6J小鼠对STZ的敏感性稍高于KM（昆明小鼠）和ICR，敏感性最低的是BALB/C小鼠。张金保等[16]也证实，C57BL/6J小鼠比ICR小鼠敏感性高，同等STZ剂量下前者成模率高于后者。笔者曾用C57BL/6J和KM小鼠同时造模以探讨二者在同样STZ剂量下的成模率，发现无论是单次大剂量（150 mg/kg）还是多次小剂量（50 mg/kg，连续5次）给药，二者的成模率没有明显差别（实验结果待发表）。该结果与刘长清等[15]、张金保等[16]的研究基本一致。考虑到KM的价格比C57BL/6J小鼠要便宜很多，所以在建立糖尿病模型时KM小鼠应该是首选动物之一。

动物的性别也会影响造模的成功率，不同的性别对STZ的敏感性不同。对于大鼠和小鼠而言，雄性比雌性更敏感[17-19]，所以目前所见到的糖尿病建模研究几乎全部采用雄性鼠。除非实验对雌性有特殊要求，建议研究者在选择糖尿病建模动物时采用雄性以提高建模成功率。

实验动物的体重也会影响糖尿病模型的成模率。郭延敏[20]研究发现，同等STZ剂量下，体重20～28 g的小鼠比30～40 g的成模率高，死亡率低。原因有可能是不同体重小鼠对STZ的敏感性和抵抗力不同。

由于上述种种原因，在建立糖尿病动物模型时选取合适的动物对实验的成功与否是非常关键的。所以小鼠建模时应选择雄性，体重以20～30 g为宜，品系以C57BL/6J和KM为佳。

2 预实验的重要性

动物在实验条件下适应性饲养1～2周后即可开始建模。但要注意的一点是，不要盲目按照文献报道的剂量直接给药建模，一定要在正式实验之前先做预实验来摸索动物的最佳用药剂量。因为小鼠的品系、性别、体重、禁食时长、药物给药途径（腹腔或是静脉）、给药方式（单次大剂量或是多次小剂量）以及药品的质量等众多因素都会影响建模的成功率。不同的实验条件下STZ的最适剂量会有差别。因此，为了不浪费药品、提高建模成功率，预实验是十分必要的。

笔者曾用同一性别、相同体重的两批KM小鼠建立1型糖尿病（type 1 diabetes，T1MD）模型，结果发现在相同的实验条件下，即相同的饲养条件和禁食时间（12 h）、同一药物品牌（STZ，Sigma）、相同剂量及处理方式（50 mg/kg连续5 d腹腔注射，配好的STZ在10 min内用完），但第一批动物的成模率明显高于第二批（实验结果未发表）。分析原因，其一可能因为两批动物来源于两家公司，虽然都是KM小鼠，但可能体质方面存在差别；其二可能是药品的差别。两次实验用的STZ都是Sigma原装进口，但却是分两次购买，批号不同；其三，第一批动物是在冬天12月建模，第二批是在春天5月建模，虽然都饲养在同一间动物房，相同的温湿度环境，但毕竟季节不同，动物本身对药物的反应也有可能会随季节不同而有所差别。当然，上述原因都是推测，还需要进一步的实验证据来证实。

总而言之，从笔者的经历和前人的经验来看，为了节约药品并保障建模成功率，预实验非常重要，最好在预实验的成模率达到一定比例后再开始大规模建模。

3 实验条件的筛选

动物选定之后，影响成模率的主要因素为禁食时间、药物剂量及给药方式，这些因素都应在预实验中筛选确定。

3.1 禁食时间的选择

禁食处理的目的：首先，禁食后动物胃肠排空，有利于STZ的吸收。其次，禁食后血糖水平和胰岛素分泌水平均下降，使STZ直接作用于胰岛β细胞，可增强STZ对胰岛β细胞的损伤程度，从而增加糖尿病模型的成模率。一般认为，禁食的时间越长，胰岛β细胞受到STZ的破坏程度就越大，即药效越高。但时间过长，死亡率也会随之增加。因此，选择合适的禁食时间对于STZ诱导糖尿病小鼠模型的成模率是十分重要的。目前大多数建模实验普遍采用禁食12 h[4，16，21-22]，也有采用禁食16 h[23]的报道。但虞冬辉等[24]研究发现，在多次小剂量STZ诱导T1MD小鼠模型时禁食时间为10 h的成模率高于禁食16 h，二者的成模率分别为90%和80%；且在4周的实验期间，禁食10 h组的模型鼠的平均血糖一直高于禁食16 h组。笔者所做的建模实验一直采用禁食12 h，成模率也較高，可达80%（已被《中国生化药物杂志》接收，待发表）。可见禁食时间采用12 h左右比较适宜。当然，不同的实验条件下最适的禁食时间也不一定相同。Furman[13]用小鼠禁食4 h、大鼠禁食6～8 h的方法也成功地建立了T1MD模型。因此，研究者可以根据自己的实验条件探索适当的禁食时间。

3.2 STZ剂量和给药方式的选择

STZ的剂量是决定成模与否的最重要因素。当剂量太低时，死亡率较低，成模率也较低；而剂量过高时，成模率升高，但死亡率也升高。对于小鼠来说，目前普遍采用一次性腹腔注射150～200 mg/kg或者连续5次（每天1次）腹腔注射40～50 mg/kg的方法[13-14，21]。单次大剂量和多次小剂量STZ注射均能建立糖尿病模型。单次大剂量给药操作简单，省时省力，用药量相对较少，可节约费用，但这种给药方式的成模率往往不如低剂量多次给药方式高，而且模型鼠的高血糖也往往不如后者稳定，血糖波动幅度大，容易逐渐降回正常值[23，25]。

笔者曾用KM小鼠比较了一次性腹腔注射150 mg/kg与连续5次注射50 mg/kg的成模率，发现150 mg/kg组的成模率在4周后低于50 mg/kg组，且前者的死亡率高于后者（已被《中国生化药物杂志》接收，待发表）。这与多数人的研究结果基本一致。因此，建议最好选择STZ低剂量多次给药方式建模。

上述所讨论的STZ剂量与给药方式都是基于腹腔注射给药进行的研究，这种给药途径是目前绝大多数糖尿病建模实验所采用的。除了腹腔注射给药途径外，STZ还可经尾静脉注射、皮下注射等方式给药。有人认为尾静脉注射较之腹腔注射具有用药量少且成模率高的特点[26]，所以不同的给药途径所需的最适剂量也有一定差别，每名实验者都应通过预实验来确定自己的最适给药剂量和给药方式。

4 实验过程中的注意事项

4.1 STZ的保存与配制

STZ见光易分解，因此在称取和分装时要避光。STZ易潮解，受潮30 min后会失去效果，因此STZ要在-20℃冰箱中干燥保存。STZ易溶于水，其水溶液在室温下极不稳定，可在数分钟内分解成气体，所以水溶液应在冰浴中配制和保存[26]，且在配制后应在30 min内完成注射（越快越好）以保障其疗效。

STZ常用pH为4.2～4.5的0.1 mol/L的柠檬酸缓冲液溶解后进行注射，这是因为在此pH范围内STZ的稳定性最好，动物的吸收效率最高。因此，STZ溶液配好后必须调节pH值至4.2～4.5。通常STZ用柠檬酸缓冲液配成1%的浓度用于注射，且要现用现配，务必在配好后的30 min之内用完，以免因时间过长而分解失效。

采用静脉方式给药时STZ溶液必须经过灭菌处理，采取腹腔和皮下给药方式可以不经灭菌处理，但为避免感染引起动物死亡，建议无论采用哪种给药途径都应当将STZ做无菌处理。笔者通常是在超净工作台中将配好的STZ溶液用0.22 μm的一次性滤器过滤除菌，操作方便，除菌效果好，且不影响STZ的药效。

4.2 给药途径选择和注射速度

虽然STZ可以通过皮下注射、腹腔注射、静脉注射等方式给药，但是，由于STZ的生物半衰期短，容易降解，所以最常被选用的给药途径为腹腔注射。这是因为此种方法操作简便，注射用时短，可以避免STZ分解。皮下注射虽然操作简单，但成功率较低，且容易感染形成皮下肿瘤，所以一般不选用此种给药方式。至于静脉注射，由于小鼠的尾静脉很细，静脉注射技术较难掌握，注射速度慢，操作误差较大，所以此种给药途径也很少使用。笔者一直采用腹腔注射给药方式建模，简单快速，成模率较高。建议实验者在注射时注意避免将针头扎入内脏，而导致死亡率增高；也要注意避免将药物注入皮下，其会降低成模率。

STZ的注射速度也会影响被试鼠的血糖。注射时推注速度较快，对动物的刺激会较大，也更容易形成高血糖模型；若推注速度较缓慢，相对的危险性降低，成模率也会降低。因此，建议快速注射以保障成模率。

4.3 造模后动物的饲养与管理

4.3.1 日常管理 小鼠成模后，饮水量及摄食量会明显增加，因此要确保饮水和饲料充足，避免小鼠因缺水少粮而相互撕咬，否则会增加感染率和死亡率。成模后小鼠的尿量会显著增加，由于高血糖鼠本身的抗病力差，一定要勤换垫料，保持垫料洁净和干燥，避免小鼠感染疾病。根据笼中小鼠数量的多少，垫料宜一天更换1～2次。

4.3.2 感染的预防与处理 造模后的小鼠往往每隔3～7 d就需采血检测一次血糖，一般采用尾部取血法。由于检测血糖所用的方法或血糖仪品牌不同，所需血量有多有少。需血量多时往往采用剪尾法，即将尾尖剪掉取血，这种方法容易形成创伤和发生感染。一旦感染发生，可采用清创消毒后涂抹红霉素软膏的方法控制感染。笔者用卓越型罗氏血糖仪检测血糖，需血量极少，用血糖试纸配送的采血针轻刺尾部即可取到足够血量，不会对小鼠造成创伤，从没发生过感染现象。鉴于上述原因，建议实验者在确定血糖检测方法时选用合适的方法和仪器，采血前要对采血部位进行消毒，采血后要对伤口进行适当处理和止血。

4.3.3 降低模型鼠死亡率的补救措施 注射STZ后，糖尿病小鼠血糖水平的改变可分为3个不同的时相：①早期高血糖相，持续1～2 h，是由于STZ抑制胰岛素的释放，使血糖迅速升高；②低血糖相，持续6～10 h，可能是胰岛β细胞被破坏，使其释放出大量的胰岛素，使血糖显著降低；③24 h后出现稳定的高血糖相即糖尿病阶段，大部分胰岛β细胞已出现不同程度的损伤和破坏，使血糖持续维持在较高的水平。血糖过低或过高都会造成小鼠死亡。为了降低小鼠的死亡率，可通过暂时补糖和注射胰岛素的方法来解决这两个问题。一般在注射STZ后的第2个时相（低血糖相）时，个别小鼠会出现持续低血糖而惊厥死亡。这种情况可在喂养饲料的同时给予5%的葡萄糖水24 h或腹腔注射20%的葡萄糖来解决。注射STZ后期，小鼠一直处于持续的高血糖状态，为避免小鼠因血糖过高而死亡，可以注射一定量的胰岛素，例如中性鱼精蛋白锌胰岛素或甘精胰岛素，每次1～3 U，即可用于缓解小鼠血糖过高的状况。

5 结语

STZ诱导法是目前建立糖尿病动物模型最常用的方法，操作简单，建模快速。采用此法建模时，药物剂量、给药方式、造模后动物的饲养与护理等都是关系到成模率的重要因素。因此，要想达到较高的成模率，上述因素都必须慎重选择。就小鼠来说，C57BL/6J和KM小鼠、禁食12 h、150～200 mg/kg STZ一次性腹腔注射或40～50 mg/kg连续5次腹腔注射是目前最常用的建模方式，实验者可根据上述原则通过预实验进一步确定和选择更适合自身实验条件的建模方法。

[参考文献]

[1] Amitani H，Asakawa A，Cheng K，et al. Hydrogen improves glycemic control in type 1 diabetic animal model by promoting glucose uptake into skeletal muscle [J]. Plos One，2013，8（1）：e53913.

[2] Ichinose K，Kawasaki E，Eguchi K. Recent advancement of understanding pathogenesis of type 1 diabetes and potential relevance to diabetic nephropathy [J]. Am J Nephrol，2007，27（6）：554-564.

[3] Homo-Delarche F，Drexhage HA. Immune cells，pancreas development，regeneration and type 1 diabetes [J]. Trends Immunol，2004，25（5）：222-229.

[4] 李甜，張亚楼，陈龙，等.链脲佐菌素诱导C57小鼠1型糖尿病模型的研究[J].现代生物医学进展，2014，14（26）：5031-5033.

[5] 孙国鹏，尹国安，张艳芳.低剂量链脲佐菌素诱导迟发性Ⅰ型糖尿病小鼠模型[J].黑龙江八一农垦大学学报，2013， 25（3）：30-33.

[6] 魏荣锐，苗明三.糖尿病动物模型及特点分析[J].中医研究，2010，23（2）：6-11.

[7] Hwang PA，Hung YL，Tsai YK，et al. The brown seaweed Sargassum hemiphyllum exhibits a-amylase and a-glucosidase inhibitory activity and enhances insulin release in vitro [J]. Cytotechnology，2015，67（4）：653–660.

[8] 孙丽华，崔海峰，孙明杰，等.链脲佐菌素制备糖尿病大鼠模型探讨[J].中国实验动物学报，2012，20（6）：15-19.

[9] 伍静，王彬鲍，臻杨，等.糖尿病动物模型的特点及影响因素分析[J].现代生物医学进展，2013，13（25）：4988-4990.

[10] Aileen JFK. The use of animal models in diabetes research [J]. Brit J Pharmacol，2012，166（3）：877-894.

[11] 嵇扬，张葵荣，王文俊.建立四氧嘧啶糖尿病模型的研究[J].中国医学刊，2003，21（7）：1125-1126.

[12] 张俭，刘杰，伍贤进.KM小鼠糖尿病动物模型的建立[J].江苏农业科学，2012，40（3）：174-175.

[13] Furman BL. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats [J]. Curr Protoc Pharmacol，2015，70：5.47.1-5.47.20.

[14] 屈彦纯，杜娥，张玥，等.糖尿病小鼠模型制备方法的初步探讨[J].医学研究杂志，2011，40（3）：78-80.

[15] 刘长青，宋立江，蒋东升，等.不同种属和禁食时间对链脲佐菌素诱导糖尿病模型的影响研究[J].实用预防医学，2010，17（2）：377-378.

[16] 张金保，庄朋伟，林映雪，等.小鼠品系、给药剂量及次数对链脲霉素诱导1型糖尿病的影响[J].中国现代医学杂志，2013，23（36）：31-35.

[17] Herberg L，Coleman DL. Laboratory animals exhibiting obesity and diabetes syndromes [J]. Metabolism，1977，26（1）：59-99.

[18] Rossini AA，Williams RM，Appel MC，et al. Sex differences in the multiple-doses streptozotocin model of diabetes [J]. Endocrinology，1978，103（4）：1518-1520.

[19] 王晓琳，邱宗荫，夏永鹏.性别差异对实验性链脲佐菌素糖尿病大鼠造模的影响[J].第三军医大学学报，2009， 31（17）：1668-1671.

[20] 郭延敏.体重和剂量对链脲佐菌素致糖尿病小鼠模型影响的研究[J].畜牧与饲料科学，2011，32（12）：17-18.

[21] 韦立顺，许忠新，田河林，等.链脲佐菌素致小鼠糖尿病模型的建立与评价[J].中国实验诊断学，2013，17（5）：806-808.

[22] Dang JK，Wu Y，Cao H，et al. Establishment of a rat model of type Ⅱ diabetic neuropathic pain [J]. Pain Medicine，2014，15（4）：637-646.

[23] 闵筱辉，陈其奎，于涛，等.链脲佐菌素诱导建立长期稳定糖尿病小鼠模型的给药方案研究[J].中国医药导报，2013，10（4）：7-10.

[24] 虞冬辉，程红科，李勇，等.禁食时间对链脲佐菌素诱导1型糖尿病小鼠模型的影响[J].中国临床医学，2013， 20（4）：472-473.

[25] 周烨文，张福梅.链脲佐菌素诱导糖尿病小鼠模型的构建[J].生物技术世界，2014，（6）：78-80.

[26] 王繼红，刘学政，杨雪佳.尾静脉注射STZ制备1型糖尿病大鼠模型实验的技巧[J].辽宁医学院学报，2010， 31（1）：7-9.

（收稿日期：2015-11-20 本文编辑：程 铭）