微流控芯片快速测定三颗针与盐酸小檗碱片中小檗碱

童艳丽 翟海云 陈缵光 霍延豪 梅华清 杨水源

[摘要] 目的 建立了微流控芯片非接触电导检测法测定三颗针与盐酸小檗碱片中小檗碱的分析方法。 方法 选择5 mmol/L 乙二胺 + 15 mmol/L H3BO3作缓冲溶液；加入0.4 mmol/L β-环糊精（β-CD） 添加剂；分离电压2.50 kV；进样时间10 s； 结果 盐酸小檗碱的线性范围为10～4.0×102 μg/mL（r = 0.997），检出限为10 μg/mL（S/N = 3），三颗针中小檗碱平均含量为0.14%，盐酸小檗碱片中小檗碱平均含量为91.6 mg/片，其平均标准偏差（RSD）分别为1.3%（n = 6）、1.4%（n = 6）。平均加标回收率分别为103%和98.9%。 结论 该方法快速、简单、高效，可为三颗针及盐酸小檗碱片提供新的分析方法。

[关键词] 微流控芯片；非接触电导检测；盐酸小檗碱；三颗针；盐酸小檗碱片

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）02（c）-0143-04

Determination of Berberine in Barberry Root and Berberine hydrochloride Tablets by Microfluidic Chip

TONG Yanli1 ZHAI Haiyun2 CHEN Zuanguang3 HUO Yanhao3 MEI Huaqing1 YANG Shuiyuan1

1.Department of Pharmacy， Guangdong No.2 Provincial People's Hospital， Guangdong Province， Guangzhou 510317， China； 2.School of Pharmacy， Guangdong Pharmaceutical University， Guangdong Province， Guangzhou 510006， China； 3.School of Pharmaceutical Sciences， Sun Yat-sen University， Guangdong Province， Guangzhou 510089， China

[Abstract] Objective To establish a new method for the determination of Berberine in Barberry Root and Berberine hydrochloride Tablets by microfluidic chip with contactless conductivity detection. Methods 5 mmol/L ethylene diamine + 15 mmol/L boric acid + 0.4 mmol/L β-CD were selected as buffer solution， 2.50 kV was chosen as separation voltage with injecting time of 10 s. Results The linear range of berberine ranged from 10 to 4.0×102 μg/mL （r = 0.997） with the detection limit of 10 μg/mL （S/N = 3）， the average recovery was 103% and 98.9% respectively. The average concentration of berberine in barberry root was 0.14% （RSD = 1.3%， n = 6） and the average content of berberine in berberine hydrochloride tablet was 91.6 mg （RSD = 1.4%， n = 6）. Conclusion The method is simple， rapid and efficient， which can provide a new analysis method for Berberine and Barberry root.

[Key words] Microfluidic chip； Contactless conductivity detection； Berberine hydrochloride； Barberry Root； Berberine hydrochloride Tablets

三颗针为小檗科（Berberidaceae）小檗属（Beris）植物的俗称，其含有的生物碱主要有小檗碱，具有清热解毒、抗菌等作用[1]。盐酸小檗碱片常用于治疗肠道感染。其分析方法包括高效液相色譜法[1-7]、紫外分光光度法[8-9]、薄层扫描法[10-11]和毛细管电泳法[12-15]等。高效液相色谱分离效率较高、定量效果好、分析速度较快，但需分离柱、高压泵及较大量的流动相，分析成本较高，且流动相多为有毒溶剂，对环境有一定污染；紫外分光光度法易受共存成分的干扰；相比而言，微流控芯片分析技术所需样品量及缓冲液量少，分析耗费低，环境污染少，样品预处理简单[16-18]。可为三颗针与盐酸小檗碱片的质量控制提供一种新的分析方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

CZG 06-1微流控芯片分析仪（自制[21]）；PMMA十字通道芯片（微通道上宽30 μm，下宽100 μm ，深30 μm，进样通道为十字结构，分离通道长44 mm，有效分离长度43 mm，由大连理工大学微系统研究中心提供）；微型压电陶瓷高压电源（自制[19]）、非接触电导检测器（高频电导检测，自制[20]）；数据处理软件（自制）；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵（巩义予华仪器有限责任公司）；LK-400A中药粉碎机（温岭市创力药材器械厂）；DA-3A超声波提取器（顺德乐从灵通电子厂）。

三羟甲基氨基甲烷（Tris），2-（N-吗啡啉）乙磺酸（MES）（上海生工生物工程有限公司）；其他试剂为国产分析纯；水为双蒸馏去离子水。所有试剂使用前均经0.22 μm的微滤膜过滤。盐酸小檗碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110713-200609）；三颗针（购自广州清平中药材市场，经广东省第二人民医院中药房副主任中药师郑艳平鉴定为三颗针）；盐酸小檗碱片（赤峰蒙欣药业有限公司，批号：150203）。

1.2 对照品和样品溶液的制备

精密称取盐酸小檗碱对照品0.0100 g，配制浓度为1.00 mg/mL的对照品溶液。4℃保存，临用时稀释成各浓度的标准溶液。

将干燥三颗针药材粉碎，过三号（50目）筛，精密称取2.0000 g，加入20 mL无水乙醇浸泡过夜，超声频率60 kHz提取30 min，振摇后静置10 min，过滤；残渣加入10 mL无水乙醇，重复超声提取0.5 h，过滤，合并两次滤液，于蒸发皿上水浴蒸干乙醇，再用適量双蒸馏去离子水溶解，定容于10 mL容量瓶，得三颗针供试品溶液。4℃保存，临用时稀释成所需浓度的供试品溶液。

精密称取盐酸小檗碱片1片量（0.1218 g），加入适量双蒸去离子水，水浴1 h，超声频率60 kHz下提取30 min，过滤，滤液用双蒸去离子水定容于50 mL容量瓶，得盐酸小檗碱片供试品溶液。4℃保存，临用时稀释成所需浓度的供试品溶液。

进样前所有溶液均用0.22 μm微孔滤膜过滤。

1.3 分离测定

新芯片使用前依次用1 mol/L HNO3、双蒸馏去离子水依次清洗芯片的通道20、10 min。实验前，先用0.1 mol/L NaOH冲洗活化通道20 min，然后用双蒸馏去离子水冲洗10 min，最后用缓冲溶液活化20 min。实验后，依次用乙醇、1 mol/L HNO3冲洗通道，再用水充满通道，以防止通道堵塞。进样电压100～500 V，分离电压500～5000 V。检测器优化的激发电压为60 V（VP-P）、激发频率为60 kHz。检测器的输出信号由数据工作站采集到微机中进行实时数据处理、图形显示和数据文件存储。实验在恒温（25℃）、恒湿（60%）条件下进行。

2 结果

2.1 线性关系、检出限

精密量取盐酸小檗碱对照品的储备液，配制成10～9.0×102 μg/mL的系列标准溶液，在优化条件下测定。在10～4.0×102 μg/mL范围内，盐酸小檗碱的峰面积（Y）与质量浓度（X）呈良好的线性关系，线性方程为Y=2.20×103X-1.56×104，相关系数r = 0.997，检出限为10 μg/mL（S/N = 3）。

2.2 精密度、样品分析及重复性试验

以浓度100.0 μg/mL的盐酸小檗碱对照品溶液，在优化实验条件下，重复进样6次，测得盐酸小檗碱峰面积的RSD为1.5%，说明精密度良好。另外精密量取三颗针及盐酸小檗碱片供试品母液稀释1/2，各自重复进样6次，根据线性方程，计算得三颗针供试品的平均浓度为1.35×102 μg/mL，稀释后的盐酸小檗碱片的平均浓度为91.6 μg/mL。从而计算得三颗针中小檗碱的平均含量为0.14 %，盐酸小檗碱片中小檗碱含量平均为91.6 mg/片。平均RSD值分别为1.3%（n = 6），1.4%（n = 6），重复性符合要求，具体样品分析图见图1。

a：三颗针的芯片毛细管电泳图；b：盐酸小檗碱片的芯片毛细管电泳图

图1 样品分析

2.3 回收率试验

将盐酸小檗碱供试品母溶液浓度稀释至2/3，根据线性方程，测得浓度为61.6 μg/mL。再用标准加入法，按照三颗针供试品溶液及盐酸小檗碱片供试品稀释后溶液浓度的120%、100%、80%加入小檗碱标准品溶液，每组测定3次，并按线性方程计算测出量浓度，最终计算得样品加标回收率分别为：三颗针103%，盐酸小檗碱98.9%，回收率在85%～115%之间，符合要求，平均RSD值分别为1.3%和1.8%。见表1。

表1 加标回收率试验结果（n = 3）

2.4 稳定性试验

按照“1.2”项下方法制备样品母溶液，并分别稀释至1/2，放置于4℃冰箱保存，并在0、4、8、12、24、36、48 h测定峰面积值的变化，结果峰面积RSD值为1.6%（n = 7），表明样品溶液在48 h内稳定。

3 讨论

缓冲溶液的组分及浓度比例、分离电压、进样时间对分离产生了较大影响，因此实验考察了上述因素对实验结果的影响，具体讨论结果如下：

首先缓冲溶液的pH值决定各组分的电离程度。小檗碱pKa值为11.50，远大于7.00，在pH值<11.50的缓冲体系中呈电离状态，可进行电泳分析，故本实验考察了多个pH值<11.50的缓冲体系，包括MES-Tris、Tris-H3BO3、Tris-H3PO4、Tris-HCl、H3PO4-NaH2PO4、HAc-NaAc、硼酸-硼砂、柠檬酸-柠檬酸钠、三乙胺- H3BO3、三乙胺-H3PO4、二乙胺-H3PO4、二乙胺-H3BO3、乙二胺-H3BO3等。结果发现：在乙二胺-H3BO3缓冲体系中，盐酸小檗碱峰形较好，基线平稳，而在其他缓冲体系中，样品无法分离或分离效果较差。因此选择乙二胺-H3BO3缓冲体系，并考察了乙二胺（5～20 mmol/L）和H3BO3（5～20 mmol/L）不同浓度配比的缓冲体系对分离检测的影响。结果表明，当乙二胺浓度高时，峰形变差，响应值变小，可能是因为乙二胺浓度升高，体系pH值升高，盐酸小檗碱电离度降低，造成目标离子浓度降低；H3BO3浓度低时，出峰变慢，灵敏度降低，高浓度时，噪音变大。因此最终缓冲体系浓度定为乙二胺（5 mmol/L）-H3BO3（15 mmol/L）。除此之外，实验考察了5%～10%甲醇、5%～10%乙醇及0.5～3.0 mmol/L的SDS，0.2-4.0 mmol/L β-CD添加剂对样品分离及检测效果的影响，结果表明甲醇、乙醇、SDS对分离无显著帮助，而当加入0.4 mmol/L β-CD时，灵敏度较之前提高。因此考虑加入0.4 mmol/L β-CD作为缓冲溶液添加剂。

其次考察了分離电压1.0～3.0 kV对样品分离检测的影响，结果发现，较低的分离电压会使样品出峰时间延长，且出现拖尾现象。过高的分离电压，电流增大，焦耳热效应使基线噪音也随之增加。综合考虑峰形、响应值、噪音等因素，优化选择分离电压为2.5 kV。

最后考察了进样时间为5.0～20.0 s对分离检测的影响。结果表明，当进样时间延长时，出峰时间减小，响应值增大。但超过10.0 s，峰形有一定的拖尾。综合考虑，优化进样时间为10.0 s。

综上所述，本分析方法操作简单，消耗样品及试剂量小，分析速度快，可为三颗针及盐酸小檗碱片中小檗碱的含量分析提供新的方法。

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（收稿日期：2015-09-30 本文编辑：赵鲁枫）