弥漫性轴索损伤对大鼠脑皮质钙释放激活钙通道调节分子1表达的影响

金涛 王松林 李东波 杨涛 宋锦宁

[摘要] 目的 研究弥漫性轴索损伤（DAI）对大鼠脑皮质钙释放激活钙通道调节分子1（ORAI1）表达的影响。 方法 利用瞬间旋转损伤装置，建立大鼠DAI模型，分为DAI组及对照组，DAI组又分为DAI组伤后6 h、1 d、3 d、7 d、14 d等5个亚组。运用苏木精-伊红（HE）染色观察大鼠DAI后脑皮质的病理生理变化；运用免疫组化检测大鼠脑皮质ORAI1的分布及表达。 结果 HE染色显示，DAI伤后6 h～1 d神经元变性、坏死、崩解数量增多，轴索的断裂和紊乱明显；DAI伤后3～14 d，开始恢复期改变，神经元的变性、水肿和坏死现象逐渐减少。免疫组化检测显示，与对照组比较，DAI伤后6 h大鼠脑皮质ORAI1的表达即开始增加，伤后1 d达高峰，伤后3～14 d逐渐降低，至伤后14 d时仍高于对照组（P < 0.05）。 结论 DAI后大鼠脑皮质ORAI1的表达水平呈先增加后降低的趋势，这一变化与大鼠DAI后脑皮质的病理生理变化有关，ORAI1可能参与DAI后的病理生理过程。

[关键词] 钙释放激活钙通道调节分子1；大鼠；弥漫性轴索损伤；病理生理

[中图分类号] R651.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）02（c）-0022-04

Influence of diffuse axonal injury on expression of ORAI1 in brain cortex of rat

JIN Tao1 WANG Songlin1 LI Dongbo1 YANG Tao1 SONG Jinning2

1.Department of Neurosurgery， Center Hospital of Ankang City， Shaanxi Province， Ankang 725000， China； 2.Department of Neurosurgery， the First Affiliated Hospital of Xi′an Jiaotong University， Shaanxi Province， Xi′an 710061， China

[Abstract] Objective To investigate influence of diffuse axonal injury （DAI） on expression of calcium release-activated calcium channel modulator 1 （ORAI1） in brain cortex of rat. Methods Lateral head-rotating device was used to establish DAI model. Rats were randomly divided into control group and DAI groups， which contained five subgroups （6 h， 1 d， 3 d， 7 d， 14 d after injury）. HE staining was used to observe pathological change in cerebral cortex after DAI and immunohistochemistry staining was applied to determine the distribution and expression of ORAI1. Results HE staining showed increased neuronal degeneration and necrosis at 6 h-1 d after DAI. Structural distortion of axons were observed. During 3 d to 14 d， neuronal recovery began. Degeneration， edema and necrosis of neuron gradually alleviated. Immunohistochemistry showed increase of ORAI1 expression began at 6 h in cortex after DAI； peaked at 1 d and gradually deceased from 3 d to 14 d； at 14 d， expression of ORAI1 still remained higher than control group （P < 0.05）. Conclusion ORAI1 expression significantly increase and then decrease in cerebral cortex of rats after DAI. Dynamic change of ORAI1 after DAI positively correlates with the pathological evolution， indicating the possible role of ORAI1 in pathophysiology of DAI.

[Key words] Calcium release-activated calcium channel modulator 1； Rat； Diffuse axonal injury； Pathophysiology

彌漫性轴索损伤（diffuse axonal injury，DAI）致残率及死亡率高，发病机制不清，临床尚无有效的治疗手段，深入揭示DAI的发病机制可以为临床治疗DAI提供新的思路。钙离子（Ca2+）是细胞信号传导过程中最常见的信使，在病理条件下，Ca2+超载在机体许多疾病的发生中都扮演着重要角色[1]。DAI后伴随着缺氧缺血，能量代谢发生障碍，胞内Ca2+浓度急剧升高，形成钙超载，导致钙依赖性酶激活、自由基形成、能量耗竭等一系列生化反应，最终导致细胞死亡。钙库调控的钙内流（store-operated calcium entry，SOCE）是非兴奋细胞主要的钙内流方式，参与机体众多的生理过程。SOCE的形成有两个关键蛋白，即基质相互作用分子1（stromal interaction molecule 1，STIM1）和钙释放激活钙通道调节分子1（calcium release-activated calcium channel modulator 1，ORAI1）[2]。既往研究发现，DAI后大鼠大脑皮质中STIM1的表达升高，其可能参与DAI后的钙超载[3]。本研究拟利用大鼠DAI模型，研究DAI后ORAI1蛋白的动态变化，探讨该蛋白在DAI后病理生理发展过程中的角色，从而为DAI的临床诊治提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选取西安交通大学医学部实验动物中心提供的2月龄、体重250～300 g、具有相同遗传背景的健康成年雄性SD大鼠60只，合格证号：SCXK（陕）08-018。该实验伦理经西安交通大学医学部生物医学伦理委员会批准。将大鼠置于（22±2）℃的环境中，在12 h照明、12 h黑暗的条件下，用标准饲料饲养7 d后开始实验。采用完全随机分组将大鼠分为对照组和DAI组，其中对照组10只，DAI组按受伤后的时间分为伤后6 h、1 d、3 d、7 d、14 d等5个亚组，每个亚组10只。具体方法为：按体重从小到大对60只大鼠进行编号，编号为从随机数字表中任选的60个随机数字，遇相同数字时，则取下一个随机数，然后对编号从小到大进行排序，从排序后的数字中规定前10个为对照组，再10个为DAI组伤后6 h，依次类推。

1.2 DAI模型的建立

DAI模型利用大鼠头颅瞬间旋转损伤装置制备[4]：大鼠经100 g/L水合氯醛麻醉（0.2～0.3 mL/100 g），成功后固定于装置，大鼠刚苏醒时，按动扳机，使大鼠头颅瞬间旋转90°，重复8次。对照组大鼠仅固定于装置上。DAI组大鼠在预定时间经盐水、多聚甲醛灌注后取脑。

1.3 实验方法

1.3.1 苏木精-伊红（HE）染色评估DAI后的病理变化 取出的大鼠脑组织继续固定48 h，石蜡包埋、切片。切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化。先后经苏木素染色、盐酸乙醇分化，切片经自来水浸泡后再置入伊红液。常规脱水，透明，封片。

1.3.2 免疫组织化学法检测ORAI1 取切片，常规脱蜡、水化，高压法抗原修复，ORAI1（浓度1∶200，博奥森，中国）采用SP染色法，具体步骤严格按照说明书操作。每个组织的免疫组化染色重复3次，每张切片随机选取6个视野（400×），Leica-Q550CW图像分析系统采集图像。采用Image-Pro Plus 6.0软件计数ORAI1阳性细胞百分比进行半定量分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0統计软件对数据进行分析和处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠脑皮质HE染色结果

与DAI组比较，对照组大鼠脑组织结构清晰，神经纤维排列整齐，无其他病理学改变；DAI组伤后6 h可见组织结构疏松、神经元水肿及轴索肿胀，部分神经元坏死；DAI组伤后1 d时组织损伤进一步加重，神经元变性、坏死、崩解数量增多，尼氏小体的数量大幅减少，甚至消失，轴索的断裂和紊乱也更加严重；DAI组伤后3～14 d，开始出现不同程度的恢复期改变，组织结构疏松减轻，神经元的变性、水肿和坏死现象逐渐减少（图1）。

A：对照组；B、C、D、E、F：DAI组伤后6 h、1 d、3 d、7 d、14 d；DAI：弥漫性轴索损伤

图1 各组大鼠脑皮质HE染色（400×）

2.2 各组大鼠脑皮质ORAI1的表达

对照组大鼠脑皮质几乎不表达ORAI1；DAI组ORAI1阳性表达位于神经元、小胶质细胞及星型胶质细胞的细胞浆，其阳性细胞百分数较对照组明显升高（图2）。各组大鼠脑皮质ORAI1的表达比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；DAI组伤后6 h时ORAI1的表达升高（P < 0.05），DAI组伤后1 d时ORAI1的表达达高峰（P < 0.05），DAI组伤后3、7、14 d，ORAI1的表达逐渐降低，但仍高于对照组（P < 0.05）。见表1。

A：对照组；B、C、D、E、F：DAI组伤后6 h、1 d、3 d、7 d、14 d；DAI：弥漫性轴索损伤；ORAI1：钙释放激活钙通道调节分子1

图2 各组大鼠脑皮质ORAI1的表达（SP染色法，400×）

表1 各组大鼠脑皮质ORAI1阳性细胞百分数比较

注：与对照组比较，*P < 0.05；与DAI组伤后6 h比较，#P < 0.05；与DAI组伤后1 d比较，▽P < 0.05；与DAI组伤后3 d比较，▲P < 0.05；与DAI组伤后7 d比较，△P < 0.05；DAI：弥漫性轴索损伤；ORAI1：钙释放激活钙通道调节分子1

3 讨论

DAI是一种特殊类型的颅脑外伤，其病理改变以广泛轴索断裂为特征，患者多预后不良[5-7]。目前DAI的发病机制仍不清楚，临床治疗手段单一，疗效欠佳，因此揭示DAI后继发的病理生理变化，可以为临床治疗DAI提供新的思路和方向，而稳定、有效的DAI模型建立是研究DAI后病理生理机制的关键。本研究采用头颅瞬间旋转装置模拟大鼠DAI模型，HE染色是评价DAI病理过程的经典方法。DAI后皮质经HE染色可见组织疏松、神经元水肿及轴索肿胀，尼氏小体减少，神经元坏死，胞体及轴索周围间隙增大，这种病理变化在伤后6 h可见，1 d时达高峰，这可能是因为DAI可以导致微循环的破裂、出血，神经元和白质的弥漫性损害，并伴随着缺氧、二氧化碳蓄积、颅内高压等引起DAI后的继发性损害；在伤后3～14 d，大脑皮质处于恢复期[8-9]。HE结果提示该模型有效，能很好地模拟DAI后的病理生理过程。

SOCE多在大多数非兴奋细胞和少数兴奋细胞内起到介导钙流入的作用，STIM1和ORAI1是形成SOCE的关键蛋白[10]。ORAI1是位于细胞膜上的选择性Ca2+通道蛋白，在静息状态下，ORAI1主要以二聚体的形式存在于细胞质膜上；其活化时需要4个分子共同组成四聚体，这个聚合体与STIM1相互作用，形成细胞外Ca2+内流的通道[11]。ORAI1参与的SOCE与蛛网膜下腔出血、脑缺血、胶质母细胞瘤及外伤性癫痫等多种中枢神经系统疾病有关，ORAI1蛋白的表达明显升高，其介导的SOCE通道开放，导致Ca2+浓度持续升高，参与疾病的病理生理过程[12-17]。在本研究中，DAI伤后6 h即可观察到ORAI1在大鼠大脑皮质内的表达升高，伤后1 d时ORAI1的表达达高峰，伤后3～14 d，ORAI1的表达逐渐降低，ORAI1表达量的动态变化提示ORAI1可能与DAI后SOCE介导的钙超载有关，但是具体的作用及可能机制仍不清楚。ORAI1的变化趋势与大脑皮质DAI后的病理变化呈时相相关，这提示DAI后大脑皮质ORAI1的表达变化参与DAI后大脑皮质的病理生理过程。此外，在本研究中，即使到了伤后14 d，ORAI1的表达仍较对照组高，提示ORAI1参与DAI后病理改变的时限较长，可能与DAI后的慢性退行性病变有关。本研究的时间点局限在伤后14 d，这是本研究的不足之处，继续深入研究ORAI1在DAI后慢性期的作用对揭示其病理机制也有一定意义。

本研究还发现，DAI后ORAI1在胞质内染色深，范围广，几乎可见于皮质内所有的细胞类型，且近年研究显示，ORAI1表达于神经元、小胶质细胞、星型胶质细胞及神经祖细胞，并参与其各自的病理变化过程[18-23]。小胶质细胞在脑外伤后最快被激活并起主要免疫作用，受损细胞释放的物质调控小胶质细胞的迁移，由STIM1和ORAI1调节的SOCE参与小胶质细胞形态的改变，并介导其活化[19-20]。本研究HE染色结果发现，DAI后伴随着大量小胶质细胞的活化，而ORAI1的表达升高可能参与此过程。神经祖细胞的增殖是神经再生的关键，细胞增殖依赖于细胞内Ca2+浓度。研究发现，SOCE参与神经前体细胞的增殖，敲除ORAI1或STIM1可以显著抑制SOCE和神经前体细胞的增殖[21]。因此，ORAI1可能也参与DAI导致的神经前体细胞的增殖。既往研究认为，SOCE在非兴奋细胞钙内流的机制中起重要作用，但是，与非兴奋细胞相似，STIM1和ORAI1也参与神经元内SOCE的形成。DAI后神经轴索的断裂分为原发性和继发性，原发性断裂发生于受伤的瞬间，而继发性断裂发生于伤后的数小时至数天。DAI后神经元内Ca2+超载在继发性轴索断裂的过程中起重要作用。DAI后，轴索膜通透性增加，细胞外Ca2+流入，轴索内Ca2+浓度升高，导致核溶解、细胞结构崩解、轴索肿胀等一系列的病理改变，钙超载是导致神经细胞死亡的最后共同通路[22]。SOCE是介导胞外Ca2+进入细胞内的重要通道之一，既往研究证实，STIM1与DAI后早期钙超载有关，而本研究发现，DAI后神经元形态的细胞内ORAI1的表达升高；这种改变在受损神经元内尤其明显，提示ORAI1可能也参与神经元内SOCE介导的钙超载，这与既往的研究结果相吻合[23]。

综上所述，DAI后大鼠脑皮质ORAI1的表达升高后逐渐降低，其表达变化趋势与DAI后大脑损伤程度一致。阐明DAI后ORAI1在相关病理过程中的作用可能揭示DAI的新機制，并为DAI的治疗提供新的思路。

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（收稿日期：2015-11-05 本文編辑：李亚聪）