小鼠肺癌模型研究进展

胥孜杭 胡洁淼 陈晓 朱诗国

[摘要] 肺癌目前是世界范围内发病率和病死率最高的恶性肿瘤，并且肺也是惡性肿瘤最容易发生远处转移的器官之一。加大肺癌的科研力度势在必行，建立合适的肺癌动物模型可为肺癌的发病原因、发病机制、预防策略及临床早期诊断和药物疗效评价等提供研究基础。其中，又因小鼠是科研中最常使用的实验动物，故本文旨在介绍目前最常用的各种小鼠肺癌模型，如化学诱导小鼠模型、转基因小鼠肺癌模型、异位移植小鼠模型、原位移植小鼠模型及小鼠肺转移模型等构建方法，以及其在科研领域中的应用。分析表明，小鼠肺癌模型不仅需要多学科的交叉渗透以拓展其研究宽度，而且也需要将各种现有模型进行更灵活的运用和更深入的探索，这样才能有所突破。

[关键词] 肺癌；小鼠肿瘤模型；应用

[中图分类号] R714.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）03（c）-0063-05

[Abstract] Currently， lung cancer is one of the most common malignant tumors， and it has the highest morbidity and mortality rate all over the world. Besides， lung is also the most prone to distal metastasis organs among a variety of malignant tumors. In this case， it is critical to put more effort in lung cancer research. Aproper animal lung cancer model provides research foundation on etiology， pathogenesis， prevention strategies， the early clinical diagnosis and efficacy evaluation research. Because mice are the most commonly used experimental animals in research， this paper introduced different methods and applications of mouse lung cancer models， such as chemical inducing model， transgenic mouse model， xenograft tumor model， orthotopic tumor model，and tumor metastatic model. According to previous reports， multidisciplinary research， versatility and in-depth exploration should be the focus to achieve breakthroughs in mouse lung cancer models.

[Key words] Lung cancer； Mouse tumor models； Application

世界肿瘤流行病学研究资料显示，在我国肺癌的发病率和死亡率已跃居恶性肿瘤之首[1]。据《2012中国肿瘤登记年报》显示，每年新发肿瘤312万例，死亡超过200万例，其中肺癌已取代肝癌，成为中国致死率最高的恶性肿瘤。由于肺毛细血管十分丰富，位于整个循环系统的中心环节，因此肺又是恶性肿瘤转移最常见的器官，据头颈部、乳腺、消化道、肾、睾丸、骨等肺外恶性肿瘤患者尸检统计，其肺转移比例可达20%～54%[2]，可见肺转移是多种肿瘤的致死原因。而肺癌疗效得不到提高的主要障碍在于其临床表现复杂，难以早期发现，诊断时大部分患者已处于晚期失去有效治疗的机会。为制订出更有效的肺癌治疗方法，加强科研力度是大势所趋，其中模拟出与人类肺癌病因、发病机制、发展过程相似的动物模型又是重中之重。在科研实验动物中，又因小鼠肺组织在形态、分子特征上与人类肺组织相近，且几乎人类所有基因都可以在小鼠身上找到同源基因[3-4]；其次，小鼠繁殖周期短、生长快、饲养方便，并且近亲繁殖的小鼠肿瘤发生率高，因此小鼠在肿瘤研究领域中被广泛使用[5]。本文主要介绍目前最常用的小鼠肺癌模型的制备方法及其应用。

1 利用不同的方法建立小鼠肺癌模型

目前常用的肺癌小鼠模型有：化学诱导模型、异位移植模型、原位移植模型、转基因模型、转移模Z型等，下面对其分别进行阐述：

1.1 化学诱导肺癌模型

化学诱导模型是指通过使用化学致癌物，常用的如苯并芘、二乙基亚硝胺、3-甲基胆蒽苯等采用口服、吸入、腹腔注射、支气管灌注或支气管黏膜下注射等方法对小鼠进行诱癌。在此类模型中，自发肺肿瘤频率最高的小鼠品系为A/J，而频率最低的则为C57BL6/J[6]小鼠。

随着流行病学对病因学调查资料的积累，化学诱癌取得了重大发展，为深入研究肿瘤形成机制提供条件。如建立小鼠被动吸烟模型，使用食物补充维生素E进行干预，发现维生素E可明显改善由香烟烟雾提取物所抑制的小鼠胚肺细胞的增殖活性，及其导致的细胞DNA损伤、细胞凋亡和细胞周期发生改变情况等，还降低了肺肿瘤发病率，说明维生素E对此模型起到了化学预防作用[7]。此外，该模型还适用于中医药的抗肺癌研究，其用时较长的特点刚好符合“慢郎中”的中药药性，如使用中药复方“阳和汤”连续给乌拉坦诱导的肺癌小鼠灌胃18周后，结果显示在肺癌形成过程中“阳和汤”对超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶（CAT）的活性及白细胞介素-2（IL-2）与肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达有回升作用，并能阻止与癌变相应的谷胱甘肽-S-转移酶（GST）活性及丙二醛（MDA）含量增高，可推迟肿瘤形成时间，降低肿瘤发生率[8]。该模型虽具有其优势，但也存在一些问题，如成瘤时间长，通常需要数月，且诱发的肿瘤一般不能很好地发生转移。

1.2 转基因肺癌模型

转基因肺癌小鼠模型就是应用基因工程技术，使小鼠体内包含有整合在基因组中的克隆DNA序列，使其能够生产出将遗传改变传递给后代的转基因小鼠，以获得带有某种遗传性疾病的小鼠模型。

有报道指出在小鼠肺肿瘤中有80%检测出Kras突变[9]。故有研究者[10]利用重组腺病毒载体表达Cre重组酶诱导K-ras G12D在小鼠肺部表达，由K-ras G12D引起肺组织肿瘤的发生，从而建立小鼠肺腺癌模型，该模型可以模拟人类肺癌散发性特征，能更好地研究肺癌在早期阶段的发生发展，然而使用腺病毒载体的诱发方式构建模型并不稳定，并且使用大量病毒诱发基因突变为瞬时过程，缺少了如间质沉积、局部浸润及转移等肿瘤进展期的特征。为了建立慢性自发肺部肿瘤的小鼠模型，我国有学者[11]利用SPC-CRE转基因小鼠与LSL K-ras G12D转基因小鼠杂交，构建一种肺组织特异性低表达Cre重组酶的SPC-CRE转基因小鼠，并对7、9个月龄小鼠肿瘤结节进行检测，证实获得了SPC-CRE-Kras双阳性转基因小鼠，建立了从肺部炎性反应到肺腺瘤进展时程较长的慢性自发肺部肿瘤小鼠模型，为肺癌病因的研究提供了更长的窗口期。

转基因小鼠肺癌模型对各期癌组织病变提供了相对足够的时间，有利于病因学及发病过程的研究，并且该模型能够条件控制基因的改变，使其在药物开发过程中具有独一无二的优势，如Ohashi等[12]通过肺特异性表达活性蛋白C的病毒载体（SP-C/SV40），建立表皮生长因子受体特殊位点EG-FRde1748-752转基因小鼠肺癌模型，发现表皮生长因子受体突变基因的活化可能是引起非小细胞肺癌对吉非替尼获得性耐药的机独特制。但此模型的局限性在于建模时间难掌握、费用较高，数量上难以满足实验需求，且还要保证转基因的相应产物（如异体抗原）不会对与肿瘤浸润转移相关的因素及药物治疗效果产生影响，故在实际应用上也受到一定限制。

1.3 异位移植模型

异位移植模型可分为皮下移植模型和肾被膜下移植模型，其中皮下移植是对肺癌进行实验研究的首选方法，由于其操作简单方便，通常只需将肿瘤细胞悬液或外科手术中采集的肿瘤组织移植到小鼠的背部、腋部、后肢等即可。曹慧慧等[13]将1×107个Lewis肺癌细胞注射于昆明种小鼠右腋皮下，观察到模型组小鼠饮食量减少，体重增加缓慢，成瘤率及肺癌形成率均为68.75%，提示使用Lewis肺癌细胞可以建立昆明种小鼠肺癌模型。又如卓莹等[14]在国内首次利用人新鲜完整肺癌组织块移植于NOD/SCID小鼠右侧前肢肩背部皮下，或经皮肺穿刺取得肿瘤小块移植于BALB/c裸小鼠肾包膜下。各代移植瘤模型的组织病理学及免疫组化表型、表皮生长因子受体和K-Ras基因检测均与来源肺癌组织相一致。其中肾包膜下移植是一种使用较少的移植方法，但由于肾包膜下血供丰富，又相对缺乏免疫防御机能，有利于提高移植肿瘤的成瘤率[15]，故通常利用此方法让肿瘤成功生长，然后再将肿瘤传代移植到小鼠皮下或原位进行研究。而对于瘤块移植模型，一般来说原代移植成功率较低，一般需重复多次方可成功，耗时较长。

皮下移植模型为目前最常用的肺癌动物模型，其在新药开发及药物疗效研究中有着举足轻重的作用，如朱亚芳等[16]在C57BL/6小鼠皮下接种Lewis肺腺癌细胞，建立小鼠Lewis肺癌移植瘤模型，观察川芎嗪联合顺铂对小鼠Lewis肺癌Mac2-结合蛋白（Mac2-BP）和血管内皮生长因子表达的影响。其次，又因皮下移植模型的肿瘤通常都接种于皮肤暴露部位，便于切除，故又有研究者利用此优势研究药物对肺癌原发瘤切除后肿瘤转移的影响，如观察中药复方“十全大补汤”对Lewis肺癌小鼠原发瘤切除后转移瘤的生长及血管生成的作用[17]。虽然皮下移植模型方便实用，但也存在局限性，如受到移植部位特异性的影响，皮下移植瘤的细胞生长脱离了原组织的微环境，导致实验结果与临床治疗效果差异较大，并且皮下接种模型周期较长，且不易出现转移，或常于未出现转移时，负荷的肿瘤就已出现破溃，难以达到实验要求等。

1.4 原位移植模型

原位移植的肺癌模型不仅有较高的肿瘤成瘤率，而且能突显肿瘤的侵袭和转移特性，从更大程度上模拟人体肺肿瘤的微环境，故该模型為目前较为理想的肺癌动物模型，常用的有以下几种：

1.4.1 支气管注射模型 Iochmann等[18]将标记有99Tcm的锡胶体（以便运用高分辨率影像定位观测）的肺癌NCI-H209细胞与Matrigel基质胶的混悬液注射进小鼠的支气管内，同时还皮下注射相同数量的细胞建立皮下模型，待11周后将小鼠全部处死，发现经支气管注射的模型组小鼠的肿瘤经研磨后，其细胞的增殖活力以及一些微观特征与实验前的状态几乎无差别，且该模型的细支气管被压缩，肺泡被侵袭和破坏，在肿瘤中心还可见坏死组织以及大量的巨噬细胞浸润，而皮下模型组均未出现这些现象。另有，张贺龙等[19]将肺癌细胞PC14/PE6及SBC-3/DOX直接注入小鼠气管以建立细支气管内的肺癌模型，并于注射后第42天将所有小鼠处死，观察肺脏表面及解剖面均未发现肿瘤生长，将肺组织制做成病理切片，经HE染色后在光学显微镜下观察，也未观察到肺癌细胞生长，说明模型建立失败，此提示经支气管注射的肺癌模型较皮下模型而言虽更接近肺癌发生规律，但此方法操作困难、成瘤率低，其运用受到较大限制。

1.4.2 肺内注射模型 胥孜杭等[20]将稳定表达虫萤光素酶的Lewis肺腺癌细胞与Matrigel按1∶1比例混匀后注射于C57 BL/6小鼠左肺，其特点是所需细胞数量少，5×104个即可成瘤，成功率达90%，且无需打开胸腔只需将左腋下皮肤剪一小口，并可利用活体成像技术监测到模型小鼠的肿瘤可转移至对侧胸廓、右肺、双侧腋下及腹股沟淋巴结等。随着肺内注射法的技术越来越成熟，有研究者还构建了IDO过表达的小鼠Lewis肺癌细胞株，以建立肺癌原位模型，并通过活体成像及生存分析方法，观察中药复方“肺积方”和黄芪甲苷对肺癌小鼠的作用[21]。此外，利用肺内注射法还可研究肿瘤细胞转移的生物学特征，如王菲等[22]对比Lewis肺癌细胞（LLC）及LLC原位接种后获得的第一代衍生细胞（R1-LLC）和R1-LLC原位接种后获得的第二代衍生细胞（R2-LLC）间的生物学特性，并比较该三种细胞在原位移植模型中的侵袭转移能力，发现这三种细胞的增殖能力虽无明显差别，但R2-LLC比R1-LLC及LLC细胞不论在体外还是体内实验中都具有更强的侵袭及转移能力。

1.4.3 胸腔注射模型 彭鹏等[23]在小鼠腋后线第6肋间胸腔或腋部皮下注射5×106个Lewis肺腺癌细胞，比较胸腔移植模型与皮下移植模型的区别，发现胸腔模型组小鼠生存期范围离散程度较皮下模型组小（P < 0.05），病程中胸腔模型组小鼠体重下降、摄食减少等恶病质体征较皮下模型组明显（P < 0.01），并且胸腔模型组还在早期就出现了胸水和肿瘤转移，而皮下模型组中未发现。其中在胸腔移植模型中出现的消瘦、食欲不振、全身脏器不同程度损害等恶病质症状为肿瘤晚期特征。故有研究者[24]利用该模型观察中药复方“银草合剂”对荷肺癌小鼠恶病质的影响，将肺癌H460细胞注射于小鼠胸腔内，以诱发恶病质，并于植入细胞后隔天灌服中药“银草合剂”，观察小鼠恶病质改善情况。3周后发现对照组小鼠的摄食量、体重、三酰甘油、血糖、白蛋白皆下降，而在用药组中则发现“银草合剂”具有明显提升白蛋白的功能（P < 0.05）。

1.5 转移模型

由于肿瘤发生转移是最重要的致死原因之一，而肺又为最常见的转移灶，故构建小鼠肺转移模型是解决临床问题的基础。

1.5.1 尾静脉注射转移模型 陈愉生等[25]将1×106个A549细胞注射入BALB/c小鼠尾静脉，第5周出现镜下肺部转移结节，第11周开始出现肺部结构大量破坏，弥漫性的肿瘤细胞及淋巴结浸润，病理证实为肺腺癌。通过尾静脉建立的转移模型可适用于多种肿瘤的转移研究，比如乳腺癌最常见的转移灶就为肺，龚宏霞等[26]用虫荧光素酶标记的小鼠乳腺癌细胞4T1（4T1-luc），通过尾静脉注射建立小鼠乳腺癌实验性肺转移模型。此外，肺转移也常见于黑色素瘤，张永慈等[27]利用黑色素瘤细胞M21经尾静脉接种于裸鼠，50 d内成瘤率达100%。除了这两种肺转移模型外，还有小鼠结肠癌细胞肺转移模型[28]、小鼠骨肉瘤肺转移模型[29]等，可见通过尾静脉建立的肺转移模型成功率高，转移特性好，受到大家青睐。此外，该模型还常为新药开发提供研究平台，如涎腺腺样囊性癌是比较常见的涎腺恶性肿瘤，虽生长缓慢，但易发生转移，利用小鼠尾静脉注射人涎腺腺样囊性癌细胞（SACC-LM）1×106个/只，建立SACC-LM实验性肺转移模型，观察新合成的可口服的精氨酸-天冬氨酸对该模型的作用[30]。虽然尾静脉注射转移模型已广泛使用，但仍值得注意的是尾静脉注射会迫使癌细胞集中于肺部毛细血管，使癌细胞从肺部溢出，导致过早出现转移，这也是其应用的局限性所在。

1.5.2 骨髓注射肺转移模型 Cutrera等[31]将5×104个肠癌细胞CT26注射入Balb/C小鼠右腿胫骨结节，经22 d后发现小鼠出现明显肺部转移，相同数量的细胞通过尾静脉的方法注射进入小鼠体内也可出现肺转移，但经皮下注射2×106个CT26细胞后却未出现肺转移情况，说明骨髓注射法所需更少的肿瘤细胞就可诱导远端的肺部转移。根据Fidler等[32]经典理论，肿瘤细胞的生长到发生转移，要经历细胞转化、增殖，毛细血管新生，细胞入侵、进入血管，形成癌栓，然后经过血液循环至肺，着床，黏附血管，部分从血管溢出至肺实质组织，最终形成肺转移瘤等多个步骤，其中尾静脉注射是将肿瘤细胞直接注射进入血管中，相对于肿瘤的正常生理转移情况来说，缺失了入侵血管前的一系列步骤，而骨髓注射具有入侵前环节，故相对来说经历了更完整的转移过程，更接近人类肿瘤发生肺转移的情况，故此模型可用于肺癌发病机制的研究，但操作难度较大。

2 结语与展望

肺癌动物模型是对肺癌进行科学研究的重要手段和平台，合适的动物模型对肺癌的发生机制、诊断及治疗的研究具有十分重要的意义。而加强对肺癌的防治以降低其发生率和病死率是一个系统工程，需要预防医学、影像学、病理学和临床医学等多学科的交叉渗透。如影像学在肺癌领域的应用，利用相位衬度成像技术，以微米尺度的空间分辨对从原位接种的肺癌小鼠取出的肿瘤组织进行成像，并定量分析，可重建清晰的三维模型，在此模型上还可发现小肿瘤结节的存在，該成果将有助于肺癌的早期诊断[33]。除了多学科的跨界合作以外，现有的肺癌小鼠模型也可灵活交叉、叠加应用，如在转基因小鼠上再利用化学诱导法建立肺癌模型，不仅可深入了解兴趣基因在肺癌中的作用机制还可研究化学致癌剂的诱癌机制。又如在肺癌研究中使用最多的异位移植模型，如今也有改良版本——肿瘤患者来源的移植瘤（patient-derived xenografts，PDXs）模型，即将各种患者来源的肿瘤组织移植到免疫缺陷或转基因小鼠的恰当部位，有研究显示使用此方法的荷瘤小鼠经过四代传代后，其基因序列还可与原代肿瘤保持一致，说明该模型可更准确地模拟原发肿瘤[34]。所以小鼠肺癌模型的研究不仅需要多领域的跨学科合作以拓展其研究宽度，同时也需要将各种现有模型进行更灵活的运用及更深入的探索，这样才能取得更大更快的突破。

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（收稿日期：2015-12-08 本文编辑：任 念）