结直肠癌的精准医学：大数据和微进展的时代

魏少忠　胡胜



•述评•

结直肠癌的精准医学：大数据和微进展的时代

魏少忠1胡胜2

胡胜主任医师，现任湖北省肿瘤医院内科主任。毕业于中山大学医学院，2003年获博士学位，2009年美国俄亥俄州立大学药学院访问学者，参与新型癌症靶向药物的研发。从事肿瘤临床工作20年，擅长各种恶性肿瘤的个体化治疗，对肺肿瘤、大肠肿瘤以及脑肿瘤都有深入研究。在肿瘤靶向治疗和免疫治疗研究中有较高造诣。学术兼职：中国抗癌协会生物治疗专业委员会委员及中国抗癌协会化疗专业委员会青年委员。长期从事癌症的靶向治疗和细胞免疫治疗的基础和临床研究工作。目前重点从事恶性肿瘤的CAR-T细胞治疗的相关研究。发表论文50余篇（SCI 6篇），专著2部，主持课题6项，参与课题8项。曾获“武汉市科技进步奖”和“优秀医务工作者”等称号。兼任《中国肿瘤》、《肿瘤学杂志》及《肿瘤防治研究杂志》中英文审稿专家。

依据大数据为基础的结直肠癌精准医学是一个有吸引力的研究方向。虽然下一代测序（next generation sequencing，NGS）技术发展迅速，但科学和实践方面的挑战导致临床上进展微小。最大的挑战是驱动突变的识别，因为除了EGFR、MLH1、PIK3CA和KRAS基因异常，结直肠癌没有其他有效的致癌驱动突变存在。发展生物信息学工具，超深度测序和监测循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）方法，以帮助确定发生率微小的驱动突变，以及评估通路的激活，并进行联合治疗的方法，有助于在将来解决上述问题。大多数候选基因组改变的发生率微小，限制了精准医学的临床实践。解决策略是发展个体化的篮子试验或雨伞试验。

结直肠肿瘤； 数据库，核酸； 精准医学； 微进展

在过去几十年中，基因组学研究的发展进一步提示，癌症是由不同的基因组异常驱动。不同的国际研究计划，如癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）、国际癌症基因组协会，或者基因组图谱，都发现了结直肠癌的基因突变组景观，揭示了每个结直肠肿瘤具有多个高水平的肿瘤分子异质性。其数据具有3V的特征：数据量大（volume of data），数据来源多（variability of data sources）和数据处理速度快（velocity of processing the data），即生命科学领域的大数据爆炸（图1）［1］。计算机信息学、分子医学和生物学、基因和基因组学的发展，对肿瘤学家最低学习要求是必须强制性继教培训和学习。

图1　基因组学研究的发展

一、精准医学的工具

从临床实践上看，检测结直肠癌基因异常的方法，越来越细微。免疫组织化学方法检测EGFR的表达，随后荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）分析KRAS将结直肠癌患者进行分层。目前，也可以用于其它基因的检测，如NRAS、FGFR1或CCND1。多基因测定法已经被开发，来量化基因表达，如RT-PCR（OncotypeDX®）、DNA阵列（Mammaprint®）或NanoString技术（ProsignaTM）。

虽然CRC主要遗传变异已发现超过20年，引入下一代的测序（NGS）技术，以及来自全基因组获得的数据关联研究已经发现了大量与CRC相关的基因。NGS技术允许快速和精确癌症基因组的分析，有针对性的基因分型在常规分子诊断中发挥着越来越重要的作用，促进癌症精准医学的发展［2］。超深测序可用于检测微小亚克隆的改变，将调节靶向治疗的继发耐药，同时，一些中心已开始在临床使用全外显子测序（whole-exome sequencing，WES）。RNA测序可以用于量化RNA表达和检测结构变化，如突变和易位。ctDNA的检测也是越来越流行，正在发展成为一种无创技术替代活检［3］，监测参与耐药的基因组改变。最后，鉴于核酸检测技术不足以获得肿瘤的全面分子谱，也需要考虑检测蛋白表达模式。几种技术正在开发，包括TheraLink测定法，其测量肿瘤样品中磷酸化蛋白的水平，以确定该通路是否被激活。

二、基因组学在结直肠癌精准医学中的应用

在转移性结直肠癌中，目前基因组学的四个潜在应用，可以提高患者的治疗效果。第一个是识别发生率更微小的致癌驱动突变。基因组驱动突变可以被定义为负责癌症进展的分子变化，因此，以这种基因为靶点消除癌基因依赖，将会有明确的治疗作用。大量研究已经发现，WNT、RAS-MAPK、PI3K、TGF-β、P53和DNA错配修复（mismatch repair）通路是结直肠癌常见的驱动突变。高通量技术已确定其他潜在的发生率微小的驱动突变，是药物的潜在靶点，如APC、TP53、KRAS、PIK3CA、FBXW7、SMAD4、TCF7L2和NRAS［4-7］。然而，识别基因组候选驱动突变的研究进展微小，尚无可预测靶向治疗效果的驱动突变。也提示一些癌症进展的驱动突变可在RNA/蛋白质水平进行检测分析，而不仅在DNA水平。

在转移性结直肠癌，基因组学的第二个可能的应用是识别参与继发耐药的基因组改变。在动物模型中，发现ERBB2、EGFR、FGFR1、PDGFRA和MAP2K1突变是原发耐药的机制。通过进行ctDNA分析和超深度测序可以实时确定继发突变事件；ctDNA的非侵入性的分析可能不仅早期发现异常基因的改变（甚至复发前），以及实时监测疾病的演变过程（与活检组织的一次应用不同）。例如，研究发现结直肠癌患者突变状态和蛋白质生物标志物浓度可以预测瑞戈非尼（regorafenib）的临床疗效［8］。

转移性结直肠癌基因组学第三种应用是识别DNA修复缺陷。使用高通量WES分析43例患者的DNA修复通路，发现CDKN1B、XRCC4、EPHX1、NFKBIZ、SMARCA4和BARD1，参与DNA修复和细胞周期调节［9］。其他研究也发现，MMR突变在家族性结直肠癌发生率最高（10.9%），其他基因突变仅为3.3%［10］。

虽然基因测序有助于发现肿瘤DNA修复缺陷，并促进个体化治疗策略，但进展微小。PARP抑制剂如奥拉帕尼（olaparib）应用于大多数修复DNA损伤相关的肿瘤。然而，MSI-H结直肠肿瘤患者，olaparib单药并没有明显疗效（与微卫星稳定患者比较）［11］。通过olaparib联合放射治疗，可能提高肿瘤杀伤作用，但毒性将增加。

晚期结直肠癌治疗中，高通量技术的第四个潜在应用是在个体层面上识别免疫逃逸机制，这是最有希望的方向。抗PD1单药治疗结直肠癌，表现出抗肿瘤活性，客观反应率为18.5%。然而，目前缺乏可能预测这类药物疗效的工具，而且也需要寻找靶点，开发其他免疫治疗。

基因组学可以有效用于评估精密免疫医学的5个不同方面：（1）从结直肠癌患者的研究已经提出，检测新抗原和突变负荷可以预测免疫检测点药物的疗效；（2）基因组学可以用来量化分析免疫检测点蛋白及其配体（如PD-1/PD-L1）的表达；（3）测序和基因表达分析可以检测抗细胞毒性T淋巴细胞（CTL）治疗耐药的癌细胞。例如，一些癌细胞存在TAP1突变或它们不表达MHCⅠ类分子，两者均导致对CTL抵抗；（4）基因组学可以用于定量和定性分析局部免疫系统，如CD8+T细胞的渗透可以预测抗PD1治疗的效果。最后，基因组学可以用于检测遗传多态性与免疫反应的水平和免疫缺陷关系。

早期检测这些基因组改变，是否一定会改善临床结果，在精准医学领域仍然进展微小，是重大的挑战之一。

三、精准医学存在的挑战和解决方法

尽管在癌症中，高通量技术和多个应用方法持续进步，但一些挑战需要解决，以提高结直肠癌的个体化治疗。最重要的限制和一些可能的解决方案叙述如下。

（一）改善驱动突变的识别

开发结直肠癌精准治疗的最大应用是提高抗肿瘤效果的幅度，因此，识别并锁定基因组驱动突变的事件，并与乘客事件区分开是关键，但这显然是一个相当大的难题。因为除了EGFR、MLH1、PIK3CA和KRAS，没有任何测序的项目报告，已确认任何基因组改变可作为临床前或临床治疗的靶点驱动突变。

最近，随着人们大规模的测序和体细胞突变相关的分类，计算生物学方法不仅可以发现高度突变的基因，而且通过与背景突变率比较，发现基因突变的阳性选择作用，以及基因表达水平和复制率，或突变的定位和对蛋白活性的预测。重要的是，这些方法也将有助于确定体细胞突变是否具有癌基因或肿瘤抑制的作用，从而作为开发靶向治疗的依据。最后，虽然探索DNA方法很深入，要考虑RNA表达水平也很重要（例如通过基因表达阵列检测），它已经被成功地用于识别肿瘤细胞的依赖基因，而且应与DNA突变进行整合，以更好地预测癌症的通路。

（二）开发更特异的靶向药物

结直肠癌未能提供个体化的医学往往与缺乏高度的生物活性和特异药物有关。例如，PIK3CA突变发生在约15%的晚期结直肠癌［12］，并已报道它是疾病的驱动突变。然而早期临床试验中，单独使用非选择性PI3K抑制剂表现为温和的反应率（4%）。第二代α选择性PI3K抑制剂特异性强，并且在动物模型体内产生更好的抑制。事实上，这些新抑制剂的初步结果表明，约7%的PIK3CA突变结直肠癌患者疗效表现为疾病稳定时间≥6月。第二个重要问题是难以获得适当或可用的药物。的确，在SHIVA研究中，只有40%（293/741）的基因组改变患者能够获得靶向治疗，而最终进行随机化后这一数值仅为26%，提示基因组检测只应该在一个可获得药物的范围内进行。

因此，加快开发针对靶点的高特异性和生物活性的药物尤为关键。

（三）抗肿瘤需要联合治疗

针对一个驱动突变应该表现为明显的抗肿瘤反应，但是，肿瘤异质性可以导致原发耐药。在体外和临床试验中，已发现两个或多个异常癌症相关基因与靶向治疗耐药相关［13］。

驱动突变的识别是靶向治疗成功的关键，不过，值得提出的是，绝大多数晚期患者会出现继发耐药，这是肿瘤适应的结果。在治疗的选择压力下，DNA或蛋白质水平改变，出现耐药克隆扩增，导致高度可变的遗传多样性和复杂的克隆结果。此外，一些研究已经报道不同转移部位的异质性，表现为不同的基因组变化，而如何处理这种水平的异质性，目前还不清楚。一项正在进行的临床试验（MATCH-R）对靶向药物初始获益后出现病情恶化患者的进展部位进行组织活检，以探索参与耐药发生的机制。针对不同的转移进展部位的多个驱动突变，使用联合治疗。

肿瘤适应的第二个机制是替代蛋白网络的激活，绕过靶向性抑制。在mTOR抑制剂治疗的患者中，已经观察到一个负反馈回路导致mTORC2激活AKT，诱导生长因子受体磷酸化（包括IGF-1R），需要联合IGF-1R或PI3K抑制剂进行治疗。此外，针对多个基因组改变的治疗已经出现临床客观缓解，包括PIK3CA基因突变和DNA修复。而且，靶向治疗的联合，以及与免疫检查点抑制剂的联合，可能是根除肿瘤细胞的关键策略。

四、针对罕见（发生率微小）的基因突变的策略

（一）临床研究的策略

精准医学包括两种不同的方法，即分层医学和个体化医学。分层医学是在特定分子变化的人群中测试一个药物，而个体化医学是研究个体化治疗是否提高了所有患者的疗效。在晚期结直肠癌，对纳入临床试验的所有患者进行筛查是分层医学的主要限制，因为当前大多数候选驱动突变率小于10%。如果假设，FGFR1扩增率约为10%，而筛查的失败率为15%左右，则共需要对8 294例患者进行筛查，以进行研究。分层医学是目前结直肠癌研究的主导模式，但事实上，随着技术的进步和生物进化，将检测到罕见的基因组突变，从而导致患者入组更加困难。因此，结直肠癌的精准医学需要开发更合适的个体化医学模型，而不是分层医学。

为了克服分层医学试验的患者入组问题，有五个可能的解决方案。首先，有必要按比例放大患者数目，筛选候选基因，以满足随后的治疗试验。有两种不同类型的个体化医学分子筛查方案：篮子试验和雨伞试验。篮子试验在多种癌症中检测单个药物对一个分子变化的效果。此设计可允许更快的识别候选患者，随后在不同类型肿瘤中评估靶向治疗的潜在价值。在NCI-MATCH跨肿瘤类型的个体化医学研究计划中［14］，包括3 000例不同类型的癌症（如结直肠癌），以便找到有效的靶向治疗药物。另一项STARTRK-2篮子试验正在根据所有实体瘤（主要是结直肠癌和肺癌患者）的NTRK1/2/3，ROS1或ALK状态探索Entrectinib的疗效。

第二个解决方案是聚集几个基因组改变作为一个单一的预测因子，例如PTEN/PI3K/Akt和Wnt/ β-catenin通常关联性强，在临床试验中可检测PI3K抑制剂的疗效。

第三种方法是在术前状态开发大多数的药物。药物开发过程通常包括几次试验，验证概念，剂量优化，生物标志物验证和发展联合方案。早期结直肠癌占50%，多次试验可以在手术前患者中进行，而不是在转移性疾病中进行，将加快药物开发。

第四种潜在的解决方案是使用新型临床前模型（例如患者来源异种移植物和离体循环肿瘤细胞培养物）。使用循环结直肠肿瘤细胞体外的基因组测序，以确定预先存在或新获得的分子改变，并进行药物敏感度测试，以确定最佳的个体化治疗。

此外，基于Ⅰ/Ⅱ期临床试验结果的药品批准可以大大加速药物的开发，如肺癌的ALK抑制剂。实例中显示，这种方法首先需要发现预后很差的相关亚型，如RAS突变型结直肠癌患者。

（二）进行合适的方法检测基因组突变

虽然结直肠癌患者分层医学的最大挑战是入组困难，但其他方面的问题也需要考虑并予以解决。最主要的问题是不可能在大量患者中进行基因组检测，这与难以获得肿瘤（转移）样本（如骨转移）以及一些样品中的癌细胞比例很低有关。可用几种方法来克服这些限制。首先，当不能获取组织标本或足够多的癌组织时，可以应用ctDNA检测替换活检。然而，使用这种技术难以量化拷贝数的改变。其次，进行深度测序可以分析低百分比癌细胞的样品，如MOSCATO试验引进NGS（1 000×）增加广泛基因组检测的可行性［15］。

此外，开发替代技术，以识别驱动突变，包括基因和蛋白表达的检测，将增加驱动突变患者的数量。例如，在WINTHER试验中［16］，正在进行基因表达的微阵列分析，并与正常（非癌）组织的基因表达比较，以进行合适的靶向治疗。

综上，结直肠癌中，基因组学所驱动的精准医学概念是有吸引力的；然而，没有证据表明它可以改善患者的预后，原因在于来自科学性和实践的挑战。在结直肠癌的领域中，最大的问题是除了EGFR、MLH1、PIK3CA和KRAS，缺乏充分明确的驱动突变［17-20］。开发癌症相关基因的分类，评估通路蛋白激活的方法，在不远的将来可以更好地识别这类驱动突变。肿瘤全基因组的表征和活化蛋白网络将指导联合治疗，以优化疗效。最后，实践中碰见的挑战是需要解决的问题。临床研究向个体化医学，而不是分层医学的方法转变，可能改善患者的预后。

最后，改善精准医学的应用方式也应考虑数据的共享问题。事实上，精准医学的两种检测模式均可以使用。一种是生物标志物公司进行检测，另一种是公共中心进行免费检测。例如法国国家癌症研究所已在学术医院免费提供所有癌症患者的基因组信息。

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Precision medicine for colorectal cancer: a big data and micro-progress era

Wei Shaozhong1，Hu Sheng2.1Department of Gastrointestinal Surgery，Hubei Cancer Hospital，Wuhan 430071，China；2Department of Medical Oncology，Hubei Cancer Hospital，Wuhan 430071，China

Hu Sheng，Email: ehusmn@163.com

Precision medicine based on big data is an attractive research field in colorectal cancer.Though the next generation sequencing （NGS） technology has developed rapidly，the challenges from science and practice aspects make the clinical progress fairly slow.In addition to EGFR，MLH1，PIK3CA and KRAS gene abnormalities，no other specific oncogenic driver mutations are found in colorectal cancer，so the biggest challenge is the identification of driver mutations.The development of bioinformatics tools，the application of deep sequencing and circulating tumor DNA （ctDNA） monitoring are helpful to determine rare driver gene mutation rate，assess pathways activation and combine different treatments，which can solve the above problems in future.The change in most candidate genomes is small，which hampers the clinical practice of precision medicine.Individual basket trial or umbrella trial may conquer the limitation.

Colorectal neoplasms； Databases，nucleic Acid； Precision medicine； Micro-progress

2016-05-25）

（本文编辑：姜争）

10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2016.05.001

430071 武汉，湖北省肿瘤医院胃肠外科1；湖北省肿瘤医院肿瘤内科2

胡胜，Email：ehusmn@163.com

魏少忠，胡胜.结直肠癌的精准医学：大数据和微进展的时代［J/CD］.中华结直肠疾病电子杂志，2016，5（5）：370-375.