盐酸小檗碱对体外阪崎克罗诺杆菌生物膜的抑制作用

景春娥，李萍，杜欣军，王硕

（天津科技大学食品营养与安全教育部重点实验室，天津300457）

盐酸小檗碱对体外阪崎克罗诺杆菌生物膜的抑制作用

景春娥，李萍，杜欣军，王硕*

（天津科技大学食品营养与安全教育部重点实验室，天津300457）

阪崎克罗诺杆菌是食源性条件致病菌，它能够在食品生产环境以及设备表面形成生物膜，从而成为食品的潜在污染源。本研究探讨了盐酸小檗碱对阪崎克罗诺杆菌生物膜的抑制作用，旨在从中药来源中寻找可以控制阪崎克罗诺杆菌生物膜的抗菌物质。采用XTT法评价了盐酸小檗碱对阪崎克罗诺杆菌粘附能力及其生物膜形成的影响。盐酸小檗碱对阪崎克罗诺杆菌的抑制效果表现出了剂量依赖性，MIC90值为512μg/mL。浓度为1024μg/mL的盐酸小檗碱能够通过降低阪崎克罗诺杆菌的粘附能力从而显著抑制生物膜的形成，并且可以部分清除阪崎克罗诺杆菌成熟的生物膜。因此，盐酸小檗碱对于预防控制阪崎克罗诺杆菌生物膜的形成以及由生物膜导致的临床感染具有潜在的应用价值。

阪崎克罗诺杆菌；生物膜；盐酸小檗碱

阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）属于肠杆菌科克罗诺杆菌属，革兰氏阴性杆菌［1］，是食源性条件致病菌，它能够感染不同年龄段的人群，主要导致早产儿或婴幼儿以及免疫功能低下的成年人患病［2-3］。研究表明，这一致病菌广泛存在于土壤、水和植物原料（如小麦、大米、药草和香料等等）［4-5］，具有生存温度范围广［6］和生物膜形成能力强的特点［7］。由于阪崎克罗诺杆菌在惰性表面容易形成生物膜，因此使用热水或消毒杀菌剂无法将其彻底清除［8］，导致这一致病菌成为食品加工过程中重要的污染源。最近一些研究发现，从食品中分离的阪崎克罗诺杆菌菌株已经对一些抗生素或杀菌剂表现出了不同程度的抗性［9］。抗生素耐药性，是一个公共健康问题，因为它可能导致常规治疗的失败，从而引起长期的慢性疾病。

小檗碱是一种异喹啉类生物碱，来自于黄连等植物的根和皮［10-11］。由于小檗碱是带正电的药物，易和带负电荷的离子或分子结合，常以氯酸盐或硫酸盐的形式存在［12］。临床中将盐酸小檗碱（berberine hydrochloride）作为常规治疗药物的主要成分，具有抗肿瘤［13］抗病毒［14］、抗菌［15-16］等多种药理活性。此外，有研究报道，盐酸小檗碱在抑制表皮葡萄球菌生物膜中发挥着重要的作用［17-18］。但是，目前对于使用盐酸小檗碱抑制阪崎克罗诺杆菌生物膜形成的报道很少，因此，本研究采用了微孔板法体外建立阪崎克罗诺杆菌生物膜模型，初步探究了盐酸小檗碱对阪崎克罗诺杆菌生物膜的抑制作用，为中药预防和控制阪崎克罗诺杆菌生物膜相关感染提供科学指导。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株

C.sakazakii ATCC BAA-894购自美国菌种保藏中心，为已经测序菌株；C.sakazakii IQCC10423购自工业微生物菌种保藏中心，是从不同阪崎克罗诺杆菌中筛选到的生物膜形成能力较强的菌株。

1.1.2药品与试剂

LB培养基：Luria-Bertani；PBS（pH7.4）（NaCl8g/L，KCl 0.2 g/L，Na2HPO41.44 g/L，KH2PO40.24 g/L）；盐酸小檗碱：中国食品药品检定研究院，110713-201212；二甲基亚砜（DMSO）：Sigma公司；XTT（2，3-Bis（2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl）-2H-tetrazolium-5-carboxanilide inner salt）、乳酸钠（L-Lactic acidsodium salt）、甲萘醌（Menadione）、多利培南（Doripenem）：购自Sigma公司。药物母液配制：盐酸小檗碱用二甲基亚砜溶解为6.4 mg/mL的药物母液，多利培南用0.85%生理盐水溶解为6.4 mg/mL的药物母液置-20℃冰箱贮存备用。

1.1.3仪器与设备

酶标仪（Multiskan spectrum）购自Thermo公司；96孔微量培养板购自Corning公司。

1.2方法

1.2.1细菌悬液的制备

按照1%的接种量将休止细菌悬液于液体LB培养基中，于37℃恒温振荡培养（150 r/min）过夜；再次按1%的接种量转接后同样条件培养2 h，菌液在600 nm处测OD值，并将其调至0.1用于后续试验。当进行药敏试验时，根据药敏反应液终浓度，菌液稀释调整为1×105CFU/mL～5×105CFU/mL，直接加入药敏板。

1.2.2药敏反应板的制备

参照文献［19-20］，采用倍比稀释法，取无菌96孔细胞培养板，于每排1号孔加LB液体培养基100 μL作空白对照；2号孔分别加菌液和受试化合物溶液混合液200 μL；12号孔阴性对照孔不含药物，只加菌液100 μL作阳性生长对照。3-11号孔各加新鲜配制的菌液100 μL；2-11号孔进行倍比稀释，使各孔的最终药物浓度分别为2048、1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL，各孔中DMSO含量均低于1%，各药敏板于37℃恒温箱培养。

1.2.3阪崎克罗诺杆菌最低抑菌浓度（MIC90值）的判定

参照文献［19-20］测定阪崎克罗诺杆菌最低抑菌浓度（MIC90值）。将配制好的药敏反应板于37℃恒温箱中，培养24 h，用酶标仪波长600 nm处测OD值。与阴性对照孔相比（只有菌生长不含药液），以OD值下降90%以上的最低浓度孔中的药物浓度为MIC90（细菌生长90%被抑制时的药物浓度）。当药物的MIC90值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计，MIC90值为最低浓度或在最低浓度以下时，不作区别，均计为“≤0.125 μg/mL”。上述实验均平行操作3次，当MIC90值能准确重复或只差一个浓度时为止，并以较高浓度作为MIC90值。

1.2.4XTT法（XTT-reduction assay）

参照文献［20］将XTT以饱和溶液的形式0.5 g/L保存在乳酸盐林格液中，用0.22 μm的滤膜过滤除菌，分装，-70℃保存；甲萘醌以100 mmol/L溶解于DMSO中，-20℃保存。在每次使用之前，取出冻存的XTT与甲萘醌，常温自然溶解。XTT-甲萘醌混合溶液中XTT终浓度为0.5 mg/mL，甲萘醌终浓度为1 mmol/L。将100 μL配制好的XTT-甲萘醌溶液加入用PBS洗过的生物膜生长孔和对照孔中。将药敏培养板于37℃避光培养90 min，用酶标仪波长490 nm处测定吸收度值。

1.2.5不同浓度盐酸小檗碱对阪崎克罗诺杆菌生物膜的作用分析

将菌悬液，接种至96孔细胞培养板，37℃培养1h，弃去上清，加入用新鲜的LB培养基配制的浓度为0、256、512、1 024、2 048 μg/mL的盐酸小檗碱，另设空白对照孔（只加培养基）与阴性对照孔（未加药的生物膜生长对照），37℃培养，24 h形成生物膜后，用PBS洗去未粘附细菌，加入XTT-甲萘醌溶液，将培养板37℃避光培养90 min，用酶标仪于波长490 nm处测定吸收度值。

1.2.6盐酸小檗碱的加入时间对阪崎克罗诺杆菌生物膜影响

预粘附阶段不加盐酸小檗碱：将菌悬液，接种至96孔细胞培养板，37℃培养1 h，弃去上清，PBS清洗，加入新鲜液体LB培养基，37℃分别培养0、1、3、5、7、12、24 h后，弃去上清，加入浓度为1 024 μg/mL的盐酸小檗碱（用新鲜液体LB培养基配制），另设空白对照孔（只加培养基）与阴性对照孔（未加药的生物膜生长对照），24 h后XTT法测定生物膜的生长动力学。

预粘附阶段加入盐酸小檗碱：将浓度为1024μg/mL的盐酸小檗碱和菌悬液同时接种至96孔细胞培养板，37℃培养1 h，弃去上清，PBS清洗，加入新鲜液体LB培养基，37℃分别培养0、1、3、5、7、12、24 h后，弃去上清，加入浓度为1 024 μg/mL的盐酸小檗碱，设空白对照孔（只加培养基）与阴性对照孔（未加药的生物膜生长对照）24 h后XTT法测定生物膜的生长动力学。

1.3数据处理

采用SPSS 16.0 for Windows软件处理，对相关数据进行统计分析。

2　结果与分析

2.1盐酸小檗碱对阪崎克罗诺杆菌的MIC90

盐酸小檗碱对阪崎克罗诺杆菌BAA-894和IQCC10423的MIC90值为512 μg/mL，见图1，多利培南对阪崎克罗诺杆菌MIC90值为0.25 μg/mL。

图1　不同浓度盐酸小檗碱对阪崎克罗诺杆菌的抑制Fig.1Inhibition effect on C.sakazakii by different concentrations of berberine hydrochloride

2.2不同浓度盐酸小檗碱对阪崎克罗诺杆菌生物膜形成的影响

将不同浓度的盐酸小檗碱处理阪崎克罗诺杆菌BAA-894和IQCC10423，24 h后XTT法测定生物膜的生长动力学，结果表明，512 μg/mL至2048 μg/mL的盐酸小檗碱对阪崎克罗诺杆菌BAA-894和IQCC10423生物膜的抑制率分别达到90%和80%，见图2和图3。

图2　不同浓度盐酸小檗碱对阪崎克罗诺杆菌BAA-894生物膜的影响Fig.2Effect of berberine hydrochloride at different concentrations on C.sakazakii BAA-894 biofilm formation

图3　不同浓度盐酸小檗碱对阪崎克罗诺杆菌IQCC10423生物膜的影响Fig.3Effect of berberine hydrochloride at different concentrations on C.sakazakii IQCC10423 biofilm formation

2.3盐酸小檗碱对阪崎克罗诺杆菌粘附功能及其生物膜发展的影响

在阪崎克罗诺杆菌BAA-894和IQCC10423起始粘附1 h后，将1024 μg/mL盐酸小檗碱加入生物膜形成的不同阶段（0、1、3、5、7、12、24 h），24 h后XTT法测定生物膜的生长动力学。结果表明，3h加入盐酸小檗碱后对两个菌株生物膜形成的抑制率分别达到90.2%和78.1%，0 h时，对两个菌株生物膜形成的抑制率分别为92.2%和86.6%。24 h时，对两个菌株生物膜的抑制率分别为53.7%和47.6%。另一方面，起始粘附期间将1 024 μg/mL盐酸小檗碱分别与BAA-894和IQCC10423共孵育1 h后，能够降低菌株的粘附能力，7 h前加入盐酸小檗碱可明显抑制两个菌株生物膜的形成能力，抑制率分别达到93%和92.5%，0 h时，对两个菌株生物膜形成的抑制率分别为93.8%和93.4%。24 h时，对两个菌株生物膜的抑制率分别为67.4%和59.2%，见图4和图5。

图4　盐酸小檗碱加入的不同时间对阪崎克罗诺杆菌BAA-894生物膜形成的影响Fig.4Effects of different addition time of berberine hydrochloride on C.sakazakii BAA-894 biofilm formation

图5　盐酸小檗碱加入的不同时间对阪崎克罗诺杆菌IQCC10423生物膜形成的影响Fig.5Effects of different addition time of berberine hydrochloride on C.sakazakii IQCC10423 biofilm formation

3　讨论

盐酸小檗碱是一种异喹啉类生物碱，对多种细菌具有较强的抑制作用［15-18］。Wang等［18］的研究发现盐酸小檗碱的浓度为15 μg/mL～30 μg/mL时，能够抑制表皮葡萄球菌的代谢活性，当浓度为30 μg/mL～45 μg/mL时，能够抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成。Kim等［22］在研究中发现盐酸小檗碱对金黄色葡萄球菌表面蛋白质SortaseA的抑制效果明显，并且对革兰氏阳性菌的MIC为50 μg/mL～400 μg/mL。廖璞等［17］的研究发现盐酸小檗碱可以有效减弱表皮葡萄球菌生物被膜的形成。但是，目前对于使用盐酸小檗碱抑制阪崎克罗诺杆菌生物膜形成的研究鲜有报道。

本试验中采用多利培南作为阳性对照，证明试验方法的有效性。由于多利培南是碳青酶烯类新广谱抗生素，对肠杆菌科细菌具有较好的杀灭作用，Mendes等［21］的研究表明多利培南浓度为0.5 μg/mL时，能抑制98.7%的肠杆菌科分离菌株，并且对超广谱β-内酰胺酶和AmpC基因介导的β-内酰胺酶产生菌株抑制率分别达到了94.3%和93.7%。因此，多利培南对于肠杆菌科的抗药性细菌引起的感染疾病的治疗是有临床应用价值的。多利培南对阪崎克罗诺杆菌MIC90值为0.25 μg/mL，盐酸小檗碱对阪崎克罗诺杆菌BAA-894和IQCC10423的MIC90值为512 μg/mL。

试验中采用的XTT法，不会损害细菌生物膜的结构，并且能检测出生物膜中细菌细胞的代谢活性。由于以前的实验已经证明阪崎克罗诺杆菌IQCC10423比ATCC BAA-894的生物膜形成能力强，实验结果表明前者对药物的耐受性比后者强。盐酸小檗碱浓度为1 024 μg/mL时对阪崎克罗诺杆菌BAA-894生物膜的抑制率为92.2%，而对IQCC10423生物膜抑制率为86.6%。这一结果表明，菌株的生物膜形成能力与其对药物的抗性具有正相关性。

在阪崎克罗诺杆菌粘附功能及其生物膜形成的测定实验中，加入1 024 μg/mL盐酸小檗碱的时间阶段不同，对阪崎克罗诺杆菌生物膜的抑制率不同。3 h前，加入盐酸小檗碱可明显抑制生物膜的形成，随着阪崎克罗诺杆菌生物膜的成熟，在24小时时盐酸小檗碱对BAA-894和IQCC10423生物膜的抑制率明显下降。此外，1h起始粘附期间，BAA-894和IQCC10423分别与1 024 μg/mL盐酸小檗碱共孵育后均降低了菌株的粘附能力，从而抑制了后续生物膜的生长与成熟。并且浓度为1 024 μg/mL的盐酸小檗碱对阪崎克罗诺杆菌成熟的生物膜具有部分清除作用。

此外，从食品中分离的阪崎克罗诺杆菌菌株已经对一些抗生素或杀菌剂表现出了不同程度的抗性［9］。Müller等［23］的研究发现，阪崎克罗诺杆菌具有编码β-内酰胺酶的基因，从而对氨苄青霉素和头孢菌素表现出了耐药性。由于抗生素的滥用，导致致病菌耐药性增加，传统抗菌药物的局限性日趋显现，因此，寻找新的抗菌制剂以及研究其抗菌机理已经成为亟待解决的问题。李立津等［24］和杨春梅等［25］的研究发现小檗碱可消除细菌的耐药质粒。Severina等［26］在研究中发现小檗碱能够穿透金葡萄球菌细胞膜，是一种多药耐药泵作用物。由此可知，盐酸小檗碱具有恢复细菌对其他抑菌药物的敏感性的能力。由于细菌生物膜也与抗生素耐药有关［27］。因此，盐酸小檗碱对阪崎克罗诺杆菌生物膜抑制作用的研究是具有重要的现实意义。

4　结论

浓度为1 024 μg/mL的盐酸小檗碱能够部分清除阪崎克罗诺杆菌成熟的生物膜，并且能够通过降低阪崎克罗诺杆菌的粘附能力而显著抑制新生物膜的形成。这一结果表明，盐酸小檗碱有可能作为抗菌剂用以控制阪崎克罗诺杆菌生物膜，从而减少其在食品加工环境的污染以及对人类的危害。

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In vitro Activity of Berberine Hydrochloride against Cronobacter sakazakii Biofilms

JING Chun-e，LI Ping，DU Xin-jun，WANG Shuo*
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Cronobacter sakazakii is an emerging pathogen which can form biofilms on the surfaces of equipment and processing environments.The biofilms of C.sakazakii are a potential source of contamination in food.In this study，the effect of berberine to inhibit C.sakazakii biofilm formation was investigated，which can help find antimicrobial substances from Chinese medical herbs to control its biofilms.The effect of berberine hydrochloride on the initial adhesion of C.sakazakii and its biofilm formation was evaluated by XTT reduction assay.The results revealed that the inhibition effect of berberine hydrochloride on C.sakazakii biofilms showed a dose dependent relationship and the MIC90of berberine hydrochloride against C.sakazakii was 512 μg/mL.Berberine hydrochloride at a concentration of 1 024 μg/mL could inhibit the early adherence of C.sakazakii，which suppressed the development of new biofilms.At this concentration，berberine hydrochloride could also partially destroy the mature biofilms.Therefore，berberine hydrochloride showed a great potential in prevention and control of biofilm formation of C.sakazakii and the biofilm-related infections caused by this pathogen.

Cronobactersakazaki；biofilm；berberinehydrochloride

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.17.033

2015-08-21

国家高技术研究发展计划（863）课题（2012AA101703）

景春娥（1985—），女（汉），博士研究生，研究方向：食品安全与检测技术。

王硕（1969—），男（汉），教授，博士，研究方向：食品安全和免疫学检测。