HPLC-ELSD法测定昆仑雪菊中氨基酸种类

刘立业

（吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林吉林132022）

HPLC-ELSD法测定昆仑雪菊中氨基酸种类

刘立业

（吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林吉林132022）

为了更好的开发、利用昆仑雪菊，研究昆仑雪菊中的氨基酸种类，建立一种高效液相色谱法-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）直接测定昆仑雪菊中氨基酸种类的分析方法。以PrevailTMC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱、梯度洗脱、漂移管温度110℃、氮气流量2.5 L/min为色谱条件，在40 min内完成20种氨基酸的检测。该方法能够简便、准确地测定昆仑雪菊中未水解氨基酸的种类，同时为昆仑雪菊中氨基酸的提取提供依据。

昆仑雪菊；氨基酸；高效液相色谱法；蒸发光散射

昆仑雪菊，学名为两色金鸡菊（Coreopsis tinctoria），是菊科金鸡菊属一年生草本植物，主要分布于新疆和田地区海拔约3 000 m的昆仑山区，有较丰富的野生资源［1］。长期以来，昆仑雪菊被和田居民当花茶饮用，可治疗燥热烦渴、高血压、心慌、胃肠不适、食欲不振、痢疾及疮疖肿毒。是具有广阔前景和研究价值的新品种［2-3］。

昆仑雪菊主要含有黄酮类、氨基酸、挥发油等成分，此外还含有多糖、皂苷、绿原酸等成分［4］。李芳等［5］报道了一种昆仑雪菊的深加工产品——沙棘、雪菊保健饮料，并系统的研究了该产品的生产工艺及产品中有效成分。昆仑雪菊中其他有效成分的研究较为成熟，唯有氨基酸的研究报道较少。

氨基酸作为人体必需的一种物质，广泛存在于天然产物中。木合布力·阿布力孜［3］等报道了一种采用氨基酸自动分析仪测定昆仑雪菊中氨基酸种类及含量的方法。该方法测定水解后昆仑雪菊中氨基酸的种类及含量，结果表明昆仑雪菊含有17种氨基酸，氨基酸总量达10.81%，其中8种为人体必需氨基酸，占氨基酸总量的40.3%。由于测定过程中，昆仑雪菊经过盐酸水解，测定结果与昆仑雪菊实际使用过程并不完全一致。因此，建立一种测定昆仑雪菊中未水解氨基酸的方法，准确测定出昆仑雪菊中未水解氨基酸的种类，可以更好的为昆仑雪菊的综合开发利用服务。

目前氨基酸的测定方法主要有分光光度法、气相色谱法、液相色谱法、毛细管电泳法及其它方法（近红外光谱法、化学发光法、荧光光谱法）、柱后衍生高效阳离子交换色谱法、柱前衍生反相高效液相色谱法、高效阴离子交换色谱积分脉冲安培检测法等［6-7］。随着分析技术的发展，近年来，高效液相色谱法-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）被应用到氨基酸的分析检测中［8-10］。本研究采用HPLC-ELSD建立一种昆仑雪菊中氨基酸种类的检测方法，为昆仑雪菊的综合开发利用提供必要的数据支持。

1　仪器与试剂

P1201高效液相色谱仪（蒸发光散射检测器）：大连依利特分析仪器有限公司；FA2004电子天平：上海仪器天平厂；氨基酸对照品：甘氨酸（Gly）、丝氨酸（Ser）、缬氨酸（Val）、谷氨酰胺（Gln）、苏氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、谷氨酸（Glu）、甲硫氨酸（Met）、半胱氨酸（Cys）、胱氨酸（Cys-Cys）、脯氨酸（Pro）、赖氨酸（Lys）、组氨酸（His）、精氨酸（Arg）、天冬氨酸（Asp）、酪氨酸（Tyr）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）：sigma试剂；乙腈（GR）、三氟乙酸、七氟丁酸：aladdin试剂；水为重蒸水；昆仑雪菊：购自新疆和田；732型离子交换树脂；氨水。

2　方法

2.1氨基酸标准品溶液的配制

精密称取20种氨基酸对照品各适量置于同一量瓶中，用0.01 mol/L盐酸溶解配置成质量浓度均为1.0 g/L对照品混合溶液。

2.2氨基酸样品溶液的配制

取挑选去杂后的昆仑雪菊10.0 g置具塞三角瓶中，加入500 mL沸水，浸泡10 min，过滤，滤液放冷后过预先处理的732阳离子交换树脂柱。待吸附完毕后，用20 BV去离子水洗涤树脂；用pH9.0氨水洗脱，收集洗脱液，除氨，浓缩，定容，过0.45 μm滤膜，既得氨基酸样品溶液。

2.3色谱条件

Prevail C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相A为乙腈，流动相B为七氟丁酸∶三氟乙酸∶水=2∶1∶1 000（体积比），梯度洗脱：0～9 min，0%A；9 min～15 min，0%～10%A；15 min～32 min，10%～20%A；32 min～40 min，25%A；流速0.8 mL/min；漂移管温度110℃；气体流量2.5 L/min；进样量10 μL。

3　结果

3.1氨基酸对照品溶液的测定

按照2.3中色谱条件，对配制完成的氨基酸对照品溶液进行测定，结果如图1所示。

图1　氨基酸对照品HPLC-ELSD色谱图Fig.1Chromatogram of amino acids standard by HPLC-ELSD

由图1可知，在此色谱条件下，20种常见氨基酸基本能达到基线分离，色谱图峰型较好。系统适用性试验结果表明，20种氨基酸理论塔板数均大于11 000，分离度最小的为1.09（Ala、Glu）

3.2昆仑雪菊中未水解氨基酸种类的测定

按照2.3中色谱条件，对配制完成的昆仑雪菊未水解氨基酸样品溶液进行测定，结果如图2所示。

由图2可知，在昆仑雪菊未水解氨基酸样品中，共检测到14中氨基酸，分别是：甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、谷氨酸、胱氨酸、赖氨酸、脯氨酸、精氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。

4　结论

1）本研究建立了一种高效液相色谱法-蒸发光散射测定昆仑雪菊中未水解氨基酸的方法：

图2　昆仑雪菊中未水解氨基酸HPLC-ELSD色谱图Fig.2Chromatogram of non hydrolysis amino acids in Coreopsis tinctoria flower by HPLC-ELSD

色谱条件：Prevail C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相A为乙腈；流动相B为七氟丁酸∶三氟乙酸∶水=2∶1∶1 000（体积比）；梯度洗脱：0～9 min，0% A；9min～15min，0%～10%A；15min～32min，10%～20% A；32 min～40 min，25%A；流速0.8 mL/min；漂移管温度110℃；气体流量2.5 L/min；进样量10 μL。

昆仑雪菊种未水解氨基酸溶液的处理方法：取挑选去杂后的昆仑雪菊10.0 g置具塞三角瓶中，加入500 mL沸水，浸泡10min，过滤，滤液放冷后过预先处理的732阳离子交换树脂柱。待吸附完毕后，用20 BV去离子水洗涤树脂；用pH9.0氨水洗脱，收集洗脱液，除氨，浓缩，定容，过0.45 μm滤膜，既得氨基酸样品溶液。

该方法可在40 min内对20中常见氨基酸进行检测。20种常见氨基酸均能达到基线分离，系统适用性试验符合定性分析要求。

2）采用以上方法对昆仑雪菊中未水解氨基酸进行测定，检测得到昆仑雪菊水浸提物中含有14种氨基酸（甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、苏氨酸*、丙氨酸、谷氨酸、胱氨酸、赖氨酸*、脯氨酸、精氨酸、缬氨酸*、异亮氨酸*、亮氨酸*和苯丙氨酸*），其中6种为人体必需氨基酸。

［1］新疆植物志编辑委员会.新疆植物志（第5卷）［M］.乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1999：93

［2］杜鹃，吴忠红.新疆昆仑雪菊总黄酮含量测定方法研究［J］.食品研究与开发，2015，36（1）：93-96

［3］木合布力·阿布力孜，张兰，张敏.昆仑雪菊中氨基酸的含量分析［J］.医药导报，2011，30（4）：431-432

［4］胡正梅，马清河.昆仑雪菊的研究进展［J］.新疆中医药，2014，32（6）：76-78

［5］李芳，孙来华，李春香，等.沙棘、雪菊保健饮料的加工工艺研究［J］.食品研究与开发，2015，36（14）：45-48

［6］于泓，牟世芬.氨基酸分析方法的研究进展［J］.分析化学，2005，33（3）：398-404

［7］车兰兰，李卫华，林勤保.氨基酸分析检测方法的研究进展［J］.氨基酸和生物资源，2011，33（2）：39-42，48

［8］鄢丹，李果.反相高效液相色谱法直接测定水蛭中14种未衍生氨基酸的含量［J］.分析化学，2006，34（5）：705-708

［9］白玉静，高晓燕，张宏桂，等.HPLC-ELSD法测定清开灵注射液中19种氨基酸含量［J］.中国中药杂志，2009，34（24）：3301-3303

［10］王玉红，申克宇，李鹏，等.高效液相色谱-蒸发光散射检测法直接检测20种未衍生基本氨基酸［J］.色谱，2011，29（9）：908-911

Determination of Amino Acids in Coreopsis tinctoria Flower from Kunlun Mountain by HPLC-ELSD

LIU Li-ye
（College of Chemistry and Pharmaceutical Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 132022，Jilin，China）

In order to explore and utilize the Coreopsis tinctoria flower more efficiently，a high performance chromatograph evaporative light-scattering detection method for the determination of amino acids was studied. The assay was conducted on PrevailTMC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）column，gradient elution，and the detection was performed at the temperature of drift tube of 110℃and the nitrogen gas flow rate of 2.5 L/min.Within 40 minutes，20 kinds of amino acids were detected.This method was simple，accurate to direct determination of amino acids in Coreopsis tinctoria flower，which provided information to extract amino acids in Coreopsis tinctoria flower.

Coreopsis tinctoria flower；amino acids；HPLC；ELSD

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.17.028

2015-11-30

吉林化工学院科学技术研究项目（2013第36号）

刘立业（1979—），男（汉），讲师，硕士，研究方向：天然产物分析。