薯蓣皂苷元对肺动脉高压大鼠肺血管重构的影响

颜 涛，徐勇刚，姚永新，杨德辉

（湖南师范大学第二附属医院，解放军第163医院，长沙 410003）

薯蓣皂苷元对肺动脉高压大鼠肺血管重构的影响

颜 涛，徐勇刚，姚永新，杨德辉

（湖南师范大学第二附属医院，解放军第163医院，长沙 410003）

目的：探讨薯蓣皂苷元（Dio）对野百合碱（MCT）诱导的肺动脉高压大鼠肺血管重构的影响。方法：将30只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、MCT组和Dio组，每组10只。MCT组和Dio组一次性腹腔注射野百合碱60 mg/kg，建立大鼠肺动脉高压模型。Dio组每天给予Dio 80mg/kg灌胃，对照组和MCT组给予相同量溶剂灌胃。待药物干预满4周后，分别测量各组干预后平均肺动脉压力（mPAP）、右心室肥大指数（RVHI）、肺小动脉管壁厚度占管径的百分比（WT%）和管壁面积占血管总面积的百分比（WA%）；采用免疫组化检测肺组织核因子-κB（NF-κB）的表达。结果：MCT组的mPAP、RVHI、WT%、WA%及NF-κB的表达水平均显著高于对照组和Dio组；经薯蓣皂苷元干预后，mPAP、RVHI、WT%、WA%及NF-κB的表达水平均明显降低。结论：薯蓣皂苷元能够缓解MCT诱导的肺动脉高压大鼠肺血管重构，其机制可能与抑制NF-κB的表达有关。

薯蓣皂苷元；野百合碱；肺动脉高压；肺血管重构；核因子-κB

肺动脉高压（PAH）是以肺动脉压力增高为特征的一类疾病，其发病机制尚未完全明确。PAH共同的病理学改变是肺血管重构，肺小动脉平滑肌细胞增殖是引起血管重构的关键因素［1-2］，而核转录因子-κB的激活可能与血管平滑肌的异常增殖有关。薯蓣皂苷元具有多种生物活性，如抑制细胞增殖、抗炎、促进凋亡等［3］。前期实验表明［4］，薯蓣皂苷元对肺动脉高压有保护作用，但尚未见有关薯蓣皂苷元是否影响肺动脉高压大鼠肺组织中NF-κB表达的报道。本研究以野百合碱诱导的肺动脉高压为模型，探讨薯蓣皂苷元对野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺肺血管重构的保护作用及机制，为其临床应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 材料 雄性健康大鼠30只，体重（180～220）g（湖南斯莱格景达实验动物有限公司）、薯蓣皂苷元［成都曼斯特生物科技有限公司，批号：MUST-14081408］、野百合碱［成都曼斯特生物科技有限公司，批号：MUST-15043011］、NF-κB单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型制备 健康雄性的 SD 大鼠30只，随机分为对照组、MCT组、Dio组。3组均用标准饲料在同等条件下喂养。对照组：腹腔内一次性注射等量生理盐水，于造模后第 1～28天给予0.5mL溶媒（5%乙醇+蒸馏水）。MCT组：腹腔内一次性注射2% MCT 溶液（60mg/kg）造模，于造模后第 1～28 天给予0.5mL溶媒。Dio组：腹腔内一次性注射2% MCT 溶液（60mg/kg）造模，于造模后第1～28天给予Dio 80mg/kg（溶于0.5mL溶媒）。

1.2.2 平均肺动脉压力（mPAP）的测定 大鼠称重，用30 mL/kg 水合氯醛腹腔注射麻醉后，按孙波［5］右心导管法测定 mPAP。

1.2.3 右心室肥厚指数（RVHI） 测压完毕后，取出心脏，分离右心室（RV）、左心室（LV）与室间隔（IVS），用电子秤分别称重，计算右心室肥厚指数（RVHI），即 RV/ （LV+IVS），并以此判断右心室的肥厚程度。

1.2.4 肺组织病理学观察 取大鼠右肺中叶以4%多聚甲醛中固定24h，石蜡包埋，连续切片，用于伊红染色（HE）和免疫组化。在400倍光镜下观察，每张切片选取外径＜50μm的肺小动脉6条，测定其管壁厚度（WT）、管径（ED）、血管总面积（TA）、血管腔面积（IA），取其平均值。以WT%和WA%作为衡量肺血管重建的指标。WT%=（2×WT/ED）×100%。WA%=（TA-IA）/TA×100%。

1.2.5 肺组织NF-κB表达 取石蜡切片，行NF-κB免疫组化染色检查，利用图像分析系统，每张切片随机选取结构较完整的直径＜100～200μm的细支气管5支，计数每支细支气管上皮细胞中胞核阳性细胞数，以其胞核阳性数占该细支气管上皮细胞总数的百分比作为该支气管上皮细胞NF-κB阳性表达率。

1.2.6 统计学处理 应用 SPSS13.0统计软件进行数据处理。实验数据以mean±SD表示。多组间比较采用单因素方差分析，其中两两比较采用 LSD-t 检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。对有相关趋势的变量采用直线相关分析，P＜0.01视为有相关关系。

2 结果

2.1 各组大鼠mPAP和RVHI变化 由表1可见，与对照组相比，MCT组的mPAP及RVHI均升高（均P＜0.01）。经薯蓣皂苷元干预后，mPAP及RVHI均较MCT组降低（均P＜0.01），但 Dio组的mPAP及RVHI较对照组均升高（均P＜0.05），提示薯蓣皂苷元具有改善肺动脉高压血流动力学的作用。

表1 3组大鼠mPAP和RVH比较

2.2 HE染色 由图1可见，肺组织HE染色显示，对照组大鼠肺小动脉管壁薄，管腔大；MCT组大鼠肺小动脉管壁厚度明显增加，管腔面积明显减小；Dio组大鼠肺小动脉管壁厚度及管腔面积介于两者之间。

图1 各组大鼠肺组织肺小动脉壁结构的变化（×400）

2.3 大鼠肺小动脉WT%和WA%的比较 由表2可见，MCT组肺小动脉WT%和WA%均高于对照组（均P＜0.01），经薯蓣皂苷元干预后，WT%和WA%均较MCT组降低（均P＜0.01），但 Dio组的mPAP及RVHI较对照组均升高（均P＜0.01），提示薯蓣皂苷元具有减轻野百合碱诱导的肺血管重构的作用。（见表2）

表2 3组大鼠肺小动脉WT%和WA%的比较

2.4 肺组织NF-κB表达 由图2及表3可见，免疫组化显示大鼠肺组织细支气管上皮细胞中表达NF-κB的阳性细胞呈棕黄色。MCT组大鼠细支气管上皮细胞胞核阳性表达率较对照组明显增加（P＜0.01）；经薯蓣皂苷元干预后，Dio组大鼠细支气管上皮细胞胞核阳性表达率较MCT组少（P＜0.01），但较对照组升高（P＜0.01）。

表3 3组大鼠肺肺组织NF-κB 表达的比较

2.5 大鼠NF-κB表达与肺小动脉WT%和WA%的相关性分析 大鼠NF-κB表达与肺小动脉WT% 和WA%呈明显正相关（（r分别为0.855和0.895，P均＜0.01）

图2 各组大鼠肺组织NF-κB免疫组化染色（×400）

3 讨论

肺动脉高压是一种临床常见的以肺血管阻力进行性升高并伴有不可逆转的肺血管构型改变主要特征，最终导致右心功能衰竭的肺血管疾病。随着对PAH发病机制研究的不断深入，肺动脉重构已成为研究的重点之一。肺血管重构是多种因素刺激肺血管平滑肌细胞增殖，细胞外基质成分增多，非肌型动脉形成新肌层化，引起肺动脉管壁增厚、官腔狭窄，最终导致肺动脉形成［6］。

野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压模型是目前国内外广泛应用的比较成熟的肺动脉高压模型，一次性小剂量（60 mg/kg）野百合碱腹腔注射就可以引起肺动脉高压［7-8］。本实验发现MCT组大鼠的mPAP和RVHI均明显升高，说明经野百合碱注射后造模成功。HE结果显示MCT组大鼠肺小动脉管壁厚度明显增加，管腔面积明显减小，同时WT%和WA%较对照组明显升高。这一病理结果符合肺动脉高压病理学改变，特别是肺血管重构中平滑肌细胞的增殖。经薯蓣皂苷元干预后，肺组织HE染色切片可观察到肺小动脉管壁变薄，管壁厚薄均匀，管腔面积扩大。同时肺小动脉的形态学分析也显示WT%和WA%均较MCT组明显降低。本结果表明薯蓣皂苷元可能是通过改善肺小动脉的重构，抑制平滑肌细胞增殖，从而降低肺动脉压力，减轻右心室后负荷，改善甚至逆转右心室肥厚的效果。

NF-κB是一种重要的转录调节因子，可在血管内皮细胞、血管平滑肌细胞等多种细胞中表达，参与控制炎症反应、细胞生长和凋亡，在疾病的血管炎性损伤中发挥重要作用［9］，同时与调节肺动脉平滑肌细胞增殖相关［10］。本实验发现，对照组大鼠肺动脉平滑肌细胞NF-κB呈低表达，MCT组大鼠肺动脉平滑肌细胞NF-κB表达显著高于对照组，经薯蓣皂苷元干预后大鼠肺动脉平滑肌细胞NF-κB也有表达，但比MCT组明显减少。而且相关分析提示大鼠NF-κB的表达与肺小动脉WT%和WA%呈正相关，说明MCT引起的大鼠肺动脉高压时NF-κB表达水平增高，肺动脉平滑肌细胞增殖明显。而薯蓣皂苷元对NF-κB的表达有抑制作用，同时大鼠肺动脉平滑肌细胞的增殖受到抑制。有文献报道，血管平滑肌细胞增殖时，NF-κB激活是必然的而且是始动环节［10］。由此推测，薯蓣皂苷元可能通过抑制肺血管平滑肌细胞的NF-κB的表达，抑制肺血管平滑肌细胞增殖，从而改善肺动脉高压大鼠的肺血管重构，减轻肺动脉高压。但有关NF-κB是如何促进平滑肌细胞增殖的发生机制仍不清楚，有待于进一步的实验研究加以探讨。

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Effect of diosgenin on pulmonary vascular remodeling in pulmonary hypertension in rats

Yan Tao， Xu Yon-gang， Yao Yong-xin， Yan De-hui
（Department of Cardiology， The Second Affiliated Hospital of Hunan Normal University No.163 Hospital of PLA， Changsha 410003， China）

Objective To evaluate the effects of diosgenin on monocrotaline-induced pulmonary arterial remodeling in rats. Methods 30 male SD rats were randomLy divided into the normal control group，the MCT group，the Dio group，with ten rats in each group.The rats in MCT group and Dio group were given a dose of 60 mg/kg monocrotaline intraperitoneally in PAH.Diosgenin （80mg/kg） were given orally for to the Dio group，and the same amount of solvent were given orally to the control group and the MCT group.4 weeks after medication，mean of pulmonary arterial pressure（MPAP）and right ventricular hypertrophy index（RVHI）were measured，and WT% and WA% of pulmonary arterioles were evaluated.The expression of factor -kappaB （NF-κB） in lung tissue was measured by immunohistochemistry. Results mPAP，RVHI，WT%，WA%，and the expression of NF-κB were increased significantly in MCT group than those in control group and Dio group. After intervention of diosgenin ，mPAP，RVHI，WT%，WA%，and the expression of NF-κB were significantly reduced. Conclusion Diosgenin could alleviate pulmonary hypertension pulmonary vascular remodeling induced by monocrotaline in PH rats，and mitigate pulmonary vascular remodeling，and its mechanism may be related to inhibiting the expression of NF-κB .

diosgenin；monocrotaline；pulmonary arterial hypertension；pulmonary vascular remodeling；nuclear factor -κB

R544.1

A

1673-016X（2016）02-0025-0

2015-12-03

湖南省卫生厅科研项目（B2010-136）

杨德辉，E-mail：258554330@qq.com