Mir-148a慢病毒表达载体构建及其稳定表达细胞系的筛选

李 悦，罗艳红，谌 思，王照飞，彭小宁

（1.湖南师范大学医学院，长沙 410006；2.湖南师范大学第一附属医院，湖南省人民医院，长沙 410005）

Mir-148a慢病毒表达载体构建及其稳定表达细胞系的筛选

李 悦1，罗艳红1，谌 思2，王照飞2，彭小宁1

（1.湖南师范大学医学院，长沙 410006；2.湖南师范大学第一附属医院，湖南省人民医院，长沙 410005）

目的： 构建人源性mir-148a慢病毒过表达载体，并筛选过表达mir-148a稳定细胞株U251、U87、BT325，鉴定mir-148a在稳定细胞系中的表达水平。方法： 设计并合成mir-148a上下游引物，PCR扩增mir-148a基因片段，经过酶切后克隆至慢病毒载体上，构建pGC-FU-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin-mir-148a过表达载体，在293T细胞中与pHelper1.0、pHelper2.0包装产生慢病毒，测定mir-148a慢病毒滴度。用构建好的慢病毒感染神经胶质瘤细胞系U251、U87、BT325，用嘌呤霉素筛选，筛选稳定细胞系后qRT-PCR检测mir-148a的表达情况。结果： 测序结果证明mir-148a慢病毒载体构建成功并获得了相应的慢病毒。嘌呤霉素筛选后获得稳定表达mir-148a的U251、U87、BT325细胞系，mir-148a表达水平在三种细胞中分别升高167.38倍、 7.19倍、11.46倍。结论： 成功构建了mir-148a的慢病毒载体，筛选得到了mir-148a过表达稳定胶质瘤细胞系U251、U87、B325。

mir-148a；慢病毒载体；神经胶质瘤细胞；q RT-PCR

微小RNA（microRNA，miRNA）是一类广泛存在于动植物中的长度为19-25个核苷酸的非编码单链小分子RNA，它是一类新的基因调控分子，其通过5’端种子序列与靶基因3’UTR互补配对，对靶基因产生负性调控作用。miRNA 与其靶基因组成了一个复杂的调控网络，控制细胞以及整个个体多种重要的生命活动，包括早期发育、细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡等［1，2］。miRNA还可以通过调控肿瘤细胞侵袭、转移等恶性生物行为而参与肿瘤的眼睛过程。

mir-148a基因定位于7号染色体p15.2，目前研究发现，多种miRNAs参与调控胶质瘤的发生发展，其中包括高表达的mir-148a［3，4］。研究发现mir-148a在胶质母细胞瘤中作为负性风险因子存在，高表达的mir-148a促进胶质母细胞瘤的恶性化进程的演变，且与患者生存率成负相关性［5，6］。Li等［7］发现mir-148a在异柠檬酸脱氢酶1（IDH1）突变型胶质瘤组织中表达下降，起到抑瘤基因的作用，这是由于在IDH1突变型胶质瘤中mir-148a启动子CpG岛甲基化抑制其表达并且促进恶性化进程。为了进一步研究mir-148a在胶质瘤中的功能及作用机制构建mir-148a慢病毒表达载体，建立mir-148a过表达的胶质瘤稳定细胞系。

1 资料与方法

1.1 实验材料 病毒载体GV369（pGC-FU-3FLAGSV40-EGFP-IRES-puromycin）、包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0、polybrene购买于上海吉凯基因公司，Taq聚合酶购买于SinoBio公司，AgeⅠ、NheⅠ、T4连接酶购于美国NEB公司，dNTP购于Takara公司，质粒抽提试剂盒购于Promega公司，台盼兰购于上海捷倍思基因技术公司，DMEM高糖培养基、胎牛血清购于Gibco公司，DMSO购于上海生物试剂厂，胰酶购于Hyclone公司，lipofecta mine2000购于Invitrogen公司，逆转录试剂盒购于Thermo公司，qRT-PCR试剂盒购于唯赞生物公司，嘌呤霉素购于Sigma公司，293T细胞、DH5α、神经胶质瘤细胞U251、U87、BT325购于广州龙龙生物有限公司。

1.2 实验方法与步骤

1.2.1 引物设计与目的片段的扩增 从miRBase数据库中搜索到mir-148a成熟序列，并由上海吉凯基因生物有限公司进行引物合成。正向引物mir-148a-F：GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGAGTTATTCTTCTTTGT CTTAGC，反向引物mir-148a-R： CACACATTCCACAGG CTAGCCCAAGGGAAAGGCGCAGCGAC，下划线区域为酶切位点，正向引物的酶切位点为AgeⅠ，反向引物的酶切位点为NheⅠ。以含有目的基因序列的cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系如下： cDNA模板 1µL，5× PCR Buffer 4µL，2.5mM dNTPs 1.6µL，10µM mir-148a-F 0.4µL，10µM mir-148a-R 0.4µL，Taq polybrene 0.2µL，ddH2O 12.4µL，总反应体系为25µL。PCR反应条件： 95℃预变性5 min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，循环30次，72℃延长10 min，4℃保存。

1.2.2 mir-148a慢病毒表达载体的构建及鉴定 将PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行分离纯化，回收目的片段。对所得目的片段进行AgeⅠ、NheⅠ双酶切，酶切后与慢病毒表达载体pGC-FU-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin质粒连接，连接反应条件为： 酶切后产物 1µL，pGC-FU-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin质粒载体 1µL，10× T4 Buffer 2µL，T4 DNA连接酶 1µL，ddH2O 13µL，总反应体系20µL。反应条件为： 16℃ 水浴反应6h。连接产物转化感受态细胞DH5α，将已转化的感受态细胞铺于AMP抗性的LB琼脂培养基上，37℃平板倒置培养过夜，挑选单克隆菌落送公司测序。

1.2.3 mir-148a慢病毒的包装和滴度测定 将pGCFU-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin -mir-148a载体20µg和pHelper1.0 15µg、pHelper2.010µg混合，按照Lipofecta mine2000说明书共转染293T细胞，37℃、5%CO2培养箱中培养8h后倒去含有转染混合物的培养基，更换成新的完全培养基继续培养48h。48h后收集细胞上清液，4℃，4000g离心10 min，去除细胞碎片，用0.45µm滤过器过滤上清液，获得慢病毒原液。测定滴度前一天，将293T细胞铺于96孔板，每个孔4×104个细胞，体积为100µL。准备7个无菌Ep管，每管加入90µL无血清培养基，取待测定的病毒原液10µL加入第一个管中，混匀后，取10µL加入第二个管中，依次类推稀释直至最后一管。选取细胞孔并做好标记后，吸弃90µL原培养基，加入90µL稀释好的病毒溶液，放入培养箱培养24h。24h后加入完全培养基100µL，继续培养96h，观察荧光表达情况，并计算病毒原液滴度，计算公式： 病毒滴度（Tu/ mL）=GFP阳性细胞数/稀释倍数。

1.2.4 mir-148a慢病毒感染神经胶质瘤细胞 将处于对数生长期的U251、U87、BT325细胞接种于24孔板，每孔细胞数为2×104个，37℃、5%CO2条件下培养至细胞融合度为70%左右时进行病毒感染，稀释病毒滴度为1×108TU/ mL，MOI=1。弃去孔板中的原培养基，加入重组慢病毒pGC-FU-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin-mir-148a混合液（无血清培养基1000 µL、pGC-FU-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin-mir-148a质粒 1µL），与此同时设立慢病毒空载体pGC-FU-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin组（无血清培养基1000µL、滴度为1×108TU/ mL的pGC-FU-3FLAGSV40-EGFP-IRES-puromycin质粒 1µL）和慢病毒阴性对照组（无血清培养基1000µL），培养8h后更换成为新鲜完全培养基，感染24h后再更换为含有嘌呤霉素（浓度为1.25µg/µL）的完全培养基进行筛选，嘌呤霉素筛选14天，培养细胞并扩增至6孔板。

1.2.5 qPCR检测稳定细胞系中mir-148a的表达 收集嘌呤霉素筛选的U251、U87、BT325细胞，用Trizol法提取总RNA，去离子水溶解沉淀，测定RNA浓度，选定RNA在A260mm/A280mm≥1.8的样品逆转录成cDNA（包括mir-148a、内参U6），逆转录反应体系及条件：①总RNA 5µg，Bulge-loop mir-148a/U6 RT primer 1µL，ddH2O to 12µL 65℃ 5 min；②5×Reacting Buffer 4µL，Rnase Inhibitor 1µL，反转录酶 1µL，10×dNTP Mixture 2µL，42℃ 60 min；70℃ 5 min；4℃保持。应用唯赞公司的qRT-PCR试剂盒检测mir-148a在稳定转染后的细胞系中的表达水平，反应体系为20µL，其中cDNA 2µL，mir-148a/U6正向引物0.8µL，mir-148a/U6通用引物 0.8µL，2× SYBR Green Mix 10µL，ddH2O to 20µL。反应条件为： 95℃预变性5 min，变性95℃ 10sec，60℃退火/延伸 30sec，循环40次。扩增过程由Bio-Rad CF×96 qPCR仪完成。每个样品设置3个复孔，重复试验3次，得出-△△CT值，按照目的基因表达量=2-△△CT公式计算各样品这个mir-148a的表达量。

1.3 数据统计分析 实验所得数据均以mean±SD表示，采用SPSS13.0进行统计分析，Hsa-mir-148a表达水平采用两组均数比较t检验分析。

2 结果

2.1 慢病毒载体pGC-FU-3FLAG-SV40-EGFPIRES-puromycin-mir-148a的构建与鉴定 在目的基因引物的两端设计了AgeⅠ、NheⅠ两个酶切位点，普通PCR扩增mir-148a基因，并将扩增产物连接于pGC-FU-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin质粒，构建慢病毒载体pGC-FU-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin-mir-148a，通过转化、培养挑选阳性克隆测序（图1），测序结果与NCBI数据库前体序列相一致（图2）。通过测序及数据库比对得到了正确的pGC-FU-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin-mir-148a重组慢病毒载体进行大量扩增，并进行质粒抽提。

图1 慢病毒重组载体pGC-FU-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin-mir-148a的部分测序结果

图2 慢病毒重组载体pGC-FU-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin-mir-148a的测序结果与NCBI数据库比对结果

2.2 慢病毒的包装和滴度测定 将慢病毒包装三质粒系统的DNA转染293T细胞，培养48h后倒置显微镜下观察，可见GFP绿色荧光（图3），证明慢病毒包装成功。收集病毒上清，4℃，4000g离心10 min，去除细胞碎片，用0.45µm滤过器过滤，分装保存于-80℃冰箱。根据病毒预期滴度，进行成倍递减稀释病毒后感染293T细胞，培养96h后观察GFP表达情况，计算得到慢病毒滴度为8×108TU/ mL。

图3 293T细胞感染mir-148a慢病毒（×200）A为可见光；B为荧光

2.3 筛选稳定过表达mir-148a的U251、U87、BT325细胞系 将mir-148a慢病毒感染神经胶质瘤细胞系U251、U87、BT325，通过14天的嘌呤霉素筛选后，更换培养皿扩大培养，获得稳定表达mir-148a的胶质瘤细胞系（图4）。

图4 mir-148a慢病毒感染胶质瘤细胞系稳定筛选结果（×200）

2.4 qPCR检测稳定转染细胞系中mir-148a表达提取稳定转染慢病毒pGC-FU-3FLAG-SV40-EGFPIRES-puromycin-mir-148载体的U251、U87、BT325三种细胞系的RNA并逆转录成cDNA后，使用qRTPCR对感染了pGC-FU-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin-mir-148a病毒载体和pGC-FU-3FLAGSV40-EGFP-IRES-puromycin病毒空载体的U251、U87、BT325细胞进行mir-148a表达水平检测，检测发现在RNA水平，mir-148a表达水平升高，其中在U251细胞系中升高167.38倍，U87细胞中升高7.19倍，BT325细胞系中升高11.46倍（图5），说明稳定细胞系构建成功。

图5 筛选的稳定细胞系U251、U87、BT325中，Mir-148a在mir-148a过表达组与对照组比较的表达情况。

3 讨论

MiRNA作为一类新型的基因表达调控小分子，参与生物体内的多种生理学或病理学功能，尤其参与到肿瘤的发生发展中，在肿瘤的迁移、转移中起到重要作用。近年来关于miRNA的功能研究越来越多。MiRNA的瞬时转染或稳定转有利于其自身功能的研究。

慢病毒载体是以HIV-1为基础发展起来的新载体，可以高效率地感染非周期性和有丝分裂细胞，使病毒基因组整合到宿主基因组，长时间、稳定表达外源性基因［8］。同时，慢病毒为自杀性病毒，感染目的细胞后不再感染其他细胞或生成新的病毒颗粒，安全性高，在复杂多样的体内和体外环境、动物模型及人类临床试验中，慢病毒的安全性也是可靠的。因此慢病毒是一类强有力的基因运输工具，成为基因研究中的热点载体。

本实验中我们采用分子技术成功构建了mir-148a慢病毒过表达载体，并成功建立了稳定表达mir-148a 的U251、U87、BT325细胞株。到目前为止，大量的研究报答mir-148a异常表达与多种肿瘤相关，其中包括胃癌［9］、肝癌［10］、骨肉瘤［11］、非小细胞肺癌［12］等，mir-148a在这些肿瘤中通过抑制靶基因的表达发挥其调控肿瘤细胞增殖、转移、侵等生物学功能的作用。由此可见，mir-148a与肿瘤的发生发展进程密切相关，但是关于mir-148a如何在肿瘤的发生发展进程中的产生作用，尤其是在神经胶质瘤中的所起到作用的深入研究的报道相对较少，因此成功构建的mir-148a慢病毒过表达载体能够为进一步研究mir-148a在胶质瘤发生发展过程中的作用奠定了坚实基础。

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Construction of mir-148a Lentiviral Expression Vector and Screening of Cell Lines for Stable Expression of mir-148a

Li Yue1，Luo Yan-hong1， Chen Si2，Wang Zhao-fei2，Peng Xiao-ning1
（1.Medical College of Hunan Normal University，Changsha 410006， China；2.The People’s Hospital of Hunan Province，Changsha，410005， China）

Objects To construct a lentivirus expression vector of has-mir-148a， to screen cell lines for stable expression of mir-148a and to test the expression level of mir-148a in stable-expression mir-148a cell lines. Methods To design and synthesis forward and reverse primer of mir-148a and use PCR amplification the purpose gene， then clone it into lentivirus vector after digesting by restriction endonuclease. After constructed the pGC-FU-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycinmir-148a overexpression vector， the overexpression vector was co-transfected with pHelper1.0、pHelper2.0 into 293T cells to abtain mir-148a lentivirus vector and detect the infection. To infect glioma cell lines U251， U87， BT325， screen the cell lines by puromycin and detect the mir-148a expression level by qRT-PCR. Results The mir-148a lentivirus vector was successfully constructed according to DNA sequencing and obtain the mir-148a lentivirus vector. Getting stable expression mir-148a cell lines U251，U87，BT325，and the expression of mir-148a was increased respectively by 167.38，7.19，11.46 in U251，U87，BT325. Conclusion mir-148a lentivirus vector is constructed successfully， and screening for the U251，U87，BT325 cell lines of stable expression mir-148a.

mir-148a； lentivirus vector； glioma ； q RT-PCR

R735.7

A

1673-016X（2016）02-0005-04

2015-08-20

国家自然科学基金项目（81472860）

彭小宁，E-mail： Pxiaoning@hunnu.edu.cn