TC-1-HPV16L1细胞模型与动物模型的建立与评价

李莉莉，王鹤蓉，周芷亦，罗 婧，周玉柏，曾 毅

（1.北京工业大学生命科学与生物工程学院，环境病毒学北京市重点实验室，北京 100124；2.中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，传染病预防控制国家重点实验室，北京 100052）

TC-1-HPV16L1细胞模型与动物模型的建立与评价

李莉莉1，王鹤蓉1，周芷亦1，罗 婧1，周玉柏1，曾 毅2

（1.北京工业大学生命科学与生物工程学院，环境病毒学北京市重点实验室，北京 100124；2.中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，传染病预防控制国家重点实验室，北京 100052）

为了解决人乳头瘤病毒16型L1蛋白（HPV16L1）为主要靶点的疫苗缺乏肿瘤模型细胞来验证疫苗的免疫效果的问题，构建了一个细胞模型并可以利用此细胞在实验动物体内形成肿瘤，用于以HPV16L1为主要靶点疫苗的验证实验.利用这个模型细胞或肿瘤模型可以在体内外检测疫苗的免疫学性质和保护功效.首先，利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的方法获得目标基因HPV16L1的基因序列并连接到载体质粒中，将质粒转染到细胞TC-1后在杀稻瘟菌素抗性压力筛选下获得稳定表达HPV16L1的细胞株.对TC-1和TC-1-HPV16L1两种细胞的生长增殖和成瘤特性进行比较发现，外源基因的加入对细胞特性没有影响.通过体外杀伤实验证实细胞TC-1-HPV16L1能够被HPV16L1靶点疫苗免疫过的小鼠脾淋巴细胞杀伤.实验动物被疫苗免疫后，进行攻瘤实验发现疫苗只对TC-1-HPV16L1组具有保护作用.综上，在本研究中成功地构建了可以检测HPV16L1疫苗的抑瘤效果的模型细胞TC-1-HPV16L1，为HPV疫苗的研究提供了一个模型细胞.

细胞模型；动物模型；人乳头瘤病毒16型L1蛋白

人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是一类常见的主要感染上皮黏膜细胞的小DNA双链病毒［1-2］.世界范围内乳头瘤病毒多达200多个亚型.HPV基因组编码9个开放阅读框，其中编码早期基因有7个，分别为E1～E7；编码晚期基因有2个，分别为L1和L2，非编码区调控病毒的转录与复制［3］.目前已经公认HPV是人子宫颈癌发生最重要的致病因子，99.7%的宫颈癌病人的标本中发现了HPV的存在［4］.流行病学研究表明，超过50%的口咽鳞状细胞癌与HPV病毒感染相关［5］.在HPV感染引起的肿瘤中，70%以上人群感染了HPV16、HPV18两个亚型［6］.

HPV病毒的晚期蛋白L1可以单独或与L2一同自发组装成为病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs），而VLPs是预防型疫苗的重要组成部分，在未感染的人体内可以激发起强烈的体液免疫应答，使机体内产生大量的中和抗体达到保护作用［7］.但是，以VLPs作为治疗型疫苗的大型临床实验由于没有产生有效的治疗作用以失败告终［8］.将HPVL1蛋白抗原利用病毒等载体递送到动物体内，则可以有效利用载体的特性激发动物的细胞免疫应答，从而达到杀伤病毒感染细胞的目的.与E6、E7这两个癌基因不同，L1蛋白与细胞的转化无关.在HPV病毒感染细胞并发生转化过程中，L1基因表达逐渐减少，有研究报道，L1蛋白在轻度/中度/重度不典型病变期（CINI/II/III）的表达分别为:83.53%、41.81%、3.13%［9］.正是因为L1在HPV感染早期有着较高的表达人群，使之成为HPV感染早期免疫干预的重要靶点.

目前，HPV感染的预防性疫苗Cervarix［10］和Gardasil［11］已经在欧美等发达国家上市，对预防HPV的感染起到了积极作用.对HPV感染后引起的病变与原位癌的治疗也在积极的研究中.但是，由于HPV病毒的特性至今无法在体外进行培养，又没有合适的易感动物模型，这给HPV病毒疫苗和药物的研发带来了不便.TC-1细胞是约翰霍普金斯大学的研究组在1996年构建的用于HPV16型肿瘤治疗型疫苗研究的模型细胞株［12］.具体的构建过程是，将携带有HPV16型病毒E6和E7基因的质粒（LXSN16E6E7）转染到C57BL/6小鼠的肺上皮细胞中，由于E6、E7基因与病毒的细胞转化密切相关，当E6和E7基因整合到小鼠肺上皮细胞时细胞发生了永生化.当把这株细胞移植到C57BL/6小鼠体内时，小鼠会有携带有E6、E7基因的肿瘤发生，从而使TC-1成为以E6、E7为靶点的抗HPV肿瘤药物的常用模型细胞.在本研究中，构建转染质粒后将HPV16L1基因整合到TC-1细胞基因组中，使TC-1细胞不但能够表达HPV16的E6和E7蛋白，还能够稳定表达L1蛋白，从而使之还可以用于以HPV16L1为靶点的疫苗的研究中.

1　材料

质粒pCDNA3.1-blasticidin、pAAV-HPV 16 L1和TC-1细胞由北京工业大学生命学院病毒药理研究所保存.限制性内切酶EcoRI-HF和NotI-HF购自NewEnglandBiology公司.T4连接酶、Golden Easy PCR System、Pfu DNA Polymerase、普通DNA产物纯化试剂盒购自于天根生化科技（北京）有限公司.DMEM培养基、RPMI 1640培养基、FBS、PBS、HBSS、GlutaMAX、HEPES、Penicillin-Streptomysin及Trypsin-EDTA（0.25%）购自Gibco公司；转染试剂FuGENE 6 Transfection Reagent购于Roche公司；HPV 16L1的单克隆抗体购于Millipore公司.Quant一步法RT-PCR试剂盒、RNAprep Pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司.DNA疫苗（pVR16-HPV16L1）、痘苗病毒载体疫苗（MVA-HPV16L1）和DNA-IL-15均由北京工业大学生命科学和生物工程学院病毒药理研究所构建并保存.

2　方法

2.1稳转细胞的获得与筛选

2.1.1转染质粒pCDNA3.1-HPV16L1的构建

根据HPV16L1基因序列设计聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）引物.上游引物为P16L1-f:GGAATTCATGAGCCTGTGGCTGCCCAG CGAGGC，下游引物P16L1-r:ATTTGCGGCCGCTC ACAGCTTCCTCTTCTTCCTCTTGG.以质粒pAAVHPV 16 L1基因为模板进行PCR.通过优化PCR反应条件获得满足实验需要的目标基因片段，利用限制性内切酶EcoRI-HF和NotI-HF对PCR产物和质粒pCDNA3.1同时进行双酶切，利用T4DNA连接酶将HPV16 L1基因片段连接到pCDNA3.1的多克隆位点，转化到感受态细胞top10中冻存，并对质粒进行酶切鉴定和序列测定.

2.1.2最佳杀稻瘟菌素（blasticidin）筛选质量浓度的确认

取未转染TC-1细胞按5×104个/孔接种至24孔板中，培养18～24 h.按质量浓度50、100、200、400、500、800 μg/mL加入blasticidin，每3 d换液1次，保持blasticidin质量浓度不变，10～14 d内能够杀死所有细胞的最小质量浓度即为最佳筛选质量浓度.

2.1.3转染

将质粒pCDNA3.1-blasticidin-HPV16L1转染到TC-1细胞中.将待转染细胞培养到单层细胞铺满50%六孔板孔底，100 μL无血清培养基将6 μL转染试剂Fugene稀释后将1 μg质粒加入其中，室温孵育15 min后滴加到六孔板的单层细胞中，在温度为37℃，CO2的体积分数为5%的培养箱中培养.

2.1.4稳转细胞系筛选

转染后培养24 h的细胞进行传代，待细胞贴壁长满T25培养底部面积50%时换液加入含400 μg/mL blasticidin的培养基.在温度为37℃、CO2占气体体积5%为培养箱中继续培养，每2～3 d换液1次，16～20 d后获得稳转细胞系TC-1-HPV16L1.

2.2稳转细胞系TC-1-HPV16L1的鉴定

2.2.1TC-1-HPV16L1细胞中HPV16L1的表达与稳定性鉴定

将TC-1-HPV16L1细胞在没有杀稻瘟菌素的DMEM培养基中继续传代培养.将第5代和第10代细胞置于T25细胞培养瓶，当细胞培养到对数生长期，经胰酶消化收集到离心管中，经磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤后，经3 000 r/min离心5 min得到细胞.利用western blot法鉴定HPV16L1蛋白的表达.具体过程:细胞样品分别加入还原型上样缓冲液进行SDS-PAGE电泳.经过转膜和封闭后，孵育一抗（即抗HPV16L1的单克隆抗体），洗涤后再孵育荧光标记的二抗.洗涤后，在Odyssey远红外影像分析仪中进行扫膜，观测结果.

2.2.2免疫组化鉴定

将1×105个细胞接种到C57BL/6小鼠体内，在肿瘤细胞接种后第20 d和第30 d分别处死一只长有细胞TC-1-HPV16L1肿瘤的小鼠，对肿瘤组织进行免疫组化鉴定，检测是否有HPV 16 L1的表达.本实验由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司完成并出具结果.

2.2.3转染前后细胞生长情况变化鉴定

TC-1-HPV16L1以104个/孔接种至E-Plate L8检测板中，将检测板置入iCELLigence主机，程序设置后，对细胞在培养板中的贴壁率进行监测，监测72 h后，将结果导出，对数据进行分析.

2.3体外杀伤实验

为了检测TC-HPV16L1细胞中所含的HPV16抗原，对细胞进行了小鼠淋巴细胞体外杀伤实验.经DNA疫苗（pVR16-HPV16L1）初免（prime）并经过痘苗病毒载体疫苗（MVA-HPV16L1）与免疫增强作用的DNA-IL-15加强（boost）后，将C57BL/6小鼠脱颈处死后取脾.研磨后过300目筛网，加入5 mLPBS，经500 r/min离心5 min，去掉上清后加入5 mL红细胞裂解液重悬，裂解5 min后，经500 r/min离心5 min，去掉上清后以5 mLDMEM培养基重悬细胞，并计数.分别将TC-1-HPV16L（5×103个/100 μL）和小鼠脾淋巴细胞（1×105个/100 μL）加入到E-PlateL8的2个孔中作为对照.在另外2个孔中加入TC-1-HPV16L1和疫苗免疫过的小鼠脾淋巴细胞的混合物，并加入可以刺激小鼠淋巴细胞产生细胞免疫的肽段.将检测板置入iCELLigence主机，对细胞在培养板中的贴壁率进行监测，监测80 h后，将结果导出，对数据进行分析.

2.4动物模型的建立与鉴定

本实验需要50只6～8周龄的C57BL/6小鼠，在右侧腹股沟皮下分别接种不同数量的TC-1细胞和TC-1-HPV16L1细胞，分组与细胞接种量如表1所示，接种后每2 d观察1次肿瘤出现及生长情况.记录接种后最早扪及肿瘤的时间、各组小鼠肿瘤生长速度及存活情况.最大接种量组小鼠的存活时间绘制生存曲线.

2.5疫苗诱导小鼠抵抗TC-1-HPV16L1肿瘤细胞攻击免疫保护检测

将20只6～8周龄的C57BL/6小鼠分为4组，见表1.其中，疫苗组在第0周免疫pVR16-HPV16L1（DNA疫苗）50 μg/只，在第2周免疫MVAHPV16L1（痘苗病毒载体疫苗）1×107pfu/只，同时注射pVR-IL-15（增强免疫作用）50 μg/只，pfu指空斑形成单位，PBS组则注射与疫苗等体积的PBS作为对照.在免疫完成后1周，在每只小鼠腹股沟皮下分别注射2×106/100 μL的TC-1-HPV16L1细胞.每3 d测量肿瘤大小，并记录最早扪及肿瘤的时间和小鼠的生存情况.

表1　肿瘤细胞攻击实验免疫动物分组与细胞数量表Table 1 Grouping and cell number of animals in tumor challenge experiments

3　结果

3.1转染质粒pCDNA3.1-blasticidin-HPV16L1的构建

转染质粒pCDNA3.1-blasticidin-HPV16L1的构建见图1.

利用PCR的方法扩增获得大小为1 518碱基对（base pair，bp）的片段，测序后与HPV16L1的基因序列完全一致.经过酶切和连接反应后，将获得新质粒pCDNA3.1-luc转染到Top10感受态细胞中.扩增培养后，提取质粒进行酶切鉴定与基因序列测定，结果与预期完全一致.

3.2筛选到的稳定转染HPV16L1的TC-1细胞鉴定

3.2.1TC-1-HPV16L1细胞中HPV16L1的表达与稳定性鉴定

HPV16L1基因如果整合到TC-1细胞的基因组中，HPV16L1蛋白便可以表达，并且在传代的过程中不会丢失.利用Western blot法，鉴定压力筛选后以及经过5代和10代传代后的TC-1-HPV16L1细胞中HPV16L1蛋白的表达情况，即可知道外源基因在TC-1细胞中的表达以及稳定情况.由图2（a）可见，在压力筛选后获得的细胞有目标蛋白HPV16L1的表达，由图2（b）可见，在传代5代和10代后，HPV16L1表达良好，说明外源基因已经整合到细胞基因组，并稳定表达.

3.2.2免疫组化鉴定

将TC-1细胞和TC-1-HPV16L1细胞分别接种到小鼠体内可以在很短时间内形成肿瘤，将肿瘤取出后，进行免疫组化实验，以鉴定HPV16L1蛋白在细胞成瘤以后的表达情况.图3（a）为TC-1的免疫组化结果，图3（b）为TC-1-HPV16L1的免疫组化结果.2张图均为400倍放大，对比可见被染色为深色区域的为HPV16L1的抗原-抗体特异性免疫反应后染色结果.在TC-1-HPV16L1细胞形成的肿瘤细胞中有明显的HPV16L1蛋白的表达.

3.2.3外源基因HPV16L1的加入对TC-1细胞培养增殖情况的影响

外源基因的加入有可能对细胞的生长增殖产生一定的影响，利用检测2种细胞在相同培养条件下，即:相同的起始细胞数量、相同的培养基、相同的培养环境下，对细胞的贴壁情况进行检测.由图4可知，代表细胞贴壁情况的参数细胞系数（cell index，CI），在大约前3 h由0.01达到0.18.反应了细胞由悬浮到贴壁的一个过程.在第3～14 h内，CI由0.18上升到0.53，也就是贴壁的细胞数量增长了大约3倍.细胞由10 000个增殖到了大约30 000个.由于E-plateL8板孔的体积和孔底表面有限，细胞在增殖到顶峰后，数量开始下降.图4中2条曲线分别代表TC-1细胞和TC-1-HPV16L1细胞，2条曲线在细胞生长到顶峰之前基本完全重合，说明外源基因HPV16L1的加入与表达对细胞的生长增殖基本没有影响.

3.3体外杀伤

将经过DNA疫苗（DNA-HPV16L1）和痘苗病毒载体疫苗（MVA-HPV16L1）以及免疫加强作用的DNA-IL15共同免疫过的小鼠脾淋巴细胞与TC-1-HPV16L1细胞共同孵育，如果L1能够被免疫细胞有效提呈，细胞将在体外杀伤实验中被溶解.利用icelligence系统能够在正常培养条件检测细胞贴壁情况的特点，将2种细胞在E-plateL8板（与icelligence配套）中混合.由图5可见，单独培养TC-1-HPV16L1细胞贴壁细胞最多，位于图的最上部分.单独培养小鼠脾淋巴细胞，由于其在体外不贴壁也不会扩增，因此，代表脾淋巴细胞的为一条平直的曲线.TC-1-HPV16L1细胞与免疫后小鼠脾淋巴细胞混合培养后，细胞增殖明显减慢.加入的脾淋巴细胞的量与最终贴壁的TC-1-HPV16L的数量成反比.即加入的脾淋巴细胞越多，存活的贴壁细胞越少.体外杀伤实验说明:被HPV16L1为靶点的疫苗免疫后，小鼠脾淋巴细胞产生了针对HPV16L1的特异性免疫应答.当这样的脾淋巴细胞在体外与表达HPV16L1抗原的肿瘤细胞相遇后，对肿瘤细胞产生抑制和杀伤作用.加入的杀伤细胞越多，杀伤的效果越加明显.图中明显的折线是由于先加入TC-1-HPV16L1细胞等其贴壁后，将E-plateL8板从培养箱中取出后再加入脾淋巴细胞导致.

3.4动物模型的构建

3.4.1细胞接种数量与肿瘤最早扪及时间比较

将筛选并鉴定好的TC-1-HPV16L1细胞皮下注射到C57BL/6小鼠的腹股沟处.为了检测外源基因HPV16L1对细胞生长的影响，设计了对比实验.表2是不同细胞接种数量，产生肿瘤最早扪及时间的统计表.细胞的接种数量越多，形成肿瘤越快.但是就TC-1和TC-1-HPV16L1两种细胞而言，在相同的接种细胞数情况下，形成肿瘤的最早扪及时间并无明显差别.

表2　模型细胞不同接种数量产生肿瘤最早扪及时间对照Table 2 Results of different number model cells to form tumor in different time

3.4.2细胞接种到小鼠体内后小鼠生存时间研究

将2×106个细胞接种到小鼠体内后，大约需要2周的时间会有可扪及的肿瘤生成，随后肿瘤逐渐增大，到60 d左右，会从0.1 cm3增大到2.5～3 cm3.实验过程中发现，肿瘤生长过大后，小鼠的皮肤被撑而变薄，在小鼠活动的过程中肿瘤很容易发生破裂的现象.而肿瘤一旦破裂将很快导致小鼠死亡.由于破裂导致小鼠非正常死亡以及个体差异，导致最终的死亡时间差异较大.由图6（a）可见，小鼠的整个带瘤生存时间在35～65 d不等.将小鼠的生存时间进行非配对t检验，比较发两者之间的差异没有统计学意义（P＞0.05）.

3.5肿瘤攻击免疫保护实验

动物攻瘤实验是肿瘤治疗型疫苗和药物效果检测的最常用手段，主要方法是对实验动物进行免疫接种后，将肿瘤细胞移植到实验动物体内，通过观察肿瘤细胞成瘤以及肿瘤的生长情况来判断疫苗或药物的作用.本研究中，为了避免肿瘤过大破裂导致的小鼠非正常死亡，使最终数据不准确，最终决定当肿瘤大于2 cm3的时候即视为小鼠疫苗死亡.由图7可见，疫苗组与PBS对照组差别显著.在80 d内，PBS组小鼠攻瘤后的45～60 d内完全死亡，死亡率100%.TC-1组，由于肿瘤细胞中不携带有HPV16L1基因不表达蛋白而无法进行有效提呈，最终表现与PBS组一致，小鼠80 d内死亡率100%.而TC-1-HPV16L1疫苗组小鼠有2只发生肿瘤（40%），并且肿瘤的发生早期生长比较缓慢，需要大约50 d肿瘤体积到约1 cm3，此后肿瘤增长变快，到大约70 d后肿瘤体积到达2 cm3.其他3只，没有产生可扪及的肿瘤，到80 d生存状态良好.由此可见，疫苗对小鼠产生了比较好的保护作用，同时证明，TC-1-HPV16L1细胞对疫苗有着良好的敏感性.

4　讨论

目前已经公认高危型HPV病毒感染与人类多种肿瘤的发生密切相关，但是并非所有感染高危型HPV病毒的人都会发生肿瘤.在HPV病毒高危型16和18型感染后超过80%的人会在自身免疫的作用下在6个月到2 a内自发痊愈，而剩余的20%的人会由于持续的感染，病毒基因发生整合导致肿瘤的发生［13］.目前针对HPV16、18型的治疗型疫苗的研究主要集中在了E6、E7两个靶点，因为E6、E7基因可以整合到了宿主细胞内，导致了细胞的癌变.但对于已经感染病变而未发生细胞转化的患者来说，HPV的L1蛋白只参与免疫反应而与细胞转化无关，是更安全的疫苗靶点［14］.

本研究的主要目的在于构建一个可以用于以HPV16L1为主要靶点的疫苗的验证实验的模型细胞，并利用此细胞在小鼠体内能够构建出肿瘤.利用这个模型细胞或肿瘤模型能够在体内外检测疫苗的免疫学性质和保护功效.为了到达这个目标，首先构建了质粒载体，并利用这个质粒将HPV16L1基因转染到了TC-1这个HPV疫苗的主要模型细胞中，并筛选到稳定表达该蛋白的细胞株.针对这个稳定表达HPV16L1的细胞株进行了一系列的验证实验.其中包括2个方面:一个方面是外源基因HPV16L1整合到TC-1细胞后，对模型细胞TC-1的自身生长增殖情况的影响，以及在动物体内成瘤特性的影响；另一方面需要验证，稳定表达HPV16L1的TC-1细胞株对以HPV16L1为靶点的疫苗免疫过的实验动物在体内外是否敏感，是否能够被疫苗免疫过动物的淋巴细胞杀伤，从而到达保护性作用.

结果显示，外源基因插入TC-1细胞基因组后，HPV16L1蛋白能够在细胞中持续稳定地表达.在体外杀伤实验中，疫苗免疫过的小鼠脾淋巴细胞对TC-1-HPV16L1细胞有明显的杀伤作用，说明细胞在体外实验中对HPV16L1为靶点的疫苗敏感.在动物模型构建的实验中，TC-1与TC-1-HPV16L1形成肿瘤所需的细胞数与时间无显著差别.体内保护性实验结果显示，肿瘤攻击后，TC-1组（包括PBS组和疫苗组）、TC-1-HPV16L1的PBS组肿瘤迅速增长，而TC-1-HPV16L1疫苗组达到了比较好的保护效果，只有40%小鼠有肿瘤发生.而且，攻击TC-1-HPV16L1细胞的疫苗组小鼠的肿瘤形成情况与其他组也不相同，初期肿瘤发生晚生长速度慢，末期才增长迅速.具体的原因与免疫反应情况有待进一步实验来进行验证.综上，成功构建了一个用于检测HPV16病毒感染治疗药物或疫苗效果的模型细胞，并利用这个细胞构建了肿瘤模型.这个模型细胞中不但包含了HPV病毒的早期基因（E基因），还包含了晚期基因L1，使TC-1这株模型细胞的用途得到了扩展.

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（责任编辑 郑筱梅）

Establishment and Evaluation of TC-1-HPV16L1 Cell Model and Animal Model

LI Lili1，WANG Herong1，ZHOU Zhiyi1，LUO Jing1，ZHOU Yubai1，ZENG Yi2
（1.Beijing Key Laboratory of Environmental and Viral Oncololgy，College of Life Science and Bio-Engineering，Beijing University of Technology，Beijing 100124，China；2.State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control，National Institute for Viral Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100052，China）

The main purpose of this research is to construct a model cell which can form tumor in experimental animals，and the model cell and model animal can be used to study the vaccine of HPV16L1 as the main target in vitro and in vivo.First of all，HPV16L1 gene sequences were obtained by polymerase chain reaction（PCR）amplification and full-length open reading frame（ORF）was constructed in-frame into the pcDNA 3.1/blasticidin expression plasmid.The cell line of stable expression of HPV16L1 was obtained by transfection of recombinant plasmid into TC-1 cell line under the resistant screening of blasticidin.The addition of exogenous gene HPV16L1 did not cause significant changes in the characteristics of cells through the comparison of proliferation and tumorigenesis between TC-1 and TC-1-HPV16L1.TC-1-HPV16L1 can be killed by the spleen lymphocytes of miceimmunized by HPV16L1 target vaccine in vitro test.Experiment of tumor challenge proved that the vaccine had protective effect on TC-1-HPV16L1 in animals.

model cell；model animal；human papillomavirus16L1

U 461；TP 308

A

0254-0037（2016）10-1581-07

10.11936/bjutxb2015090056

2015-09-21

国家“863”计划资助项目（2012AA02A404）

李莉莉（1979—），女，博士研究生，主要从事病毒感染引起的肿瘤预防与治疗型疫苗方面的研究，E-mail:chuji79 @126.com

周玉柏（1976—），男，副教授，主要从事免疫与病毒学方面的研究，E-mail:zhouyubai@bjut.edu.cn