miR-320及下游靶基因survivin在银屑病皮损中的表达

卫艳萍，张如幸，史四季，刘秀琴，赵林栋



• 论 著 •

miR-320及下游靶基因survivin在银屑病皮损中的表达

卫艳萍，张如幸，史四季，刘秀琴，赵林栋

卫艳萍

目的 检测寻常性银屑病皮损中miR-320及其下游靶基因survivin mRNA的表达水平。方法 采用实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测40例寻常性银屑病患者皮损及40名健康对照皮肤中miR-320、survivin mRNA的表达水平，运用双荧光素酶报告实验验证survivin是miR-320的靶基因。miR-320和survivin表达水平两组间比较采用t检验，寻常性银屑病皮损中miR-320与survivin表达的相关性采用Pearson相关分析。结果 与健康对照皮肤相比，寻常性银屑病皮损中miR-320表达量为对照组的（0.561±0.11）倍，表达明显下调（t=3.06，P＜0.05）；survivin mRNA表达量为对照组的（2.034±0.26）倍，表达水平明显上调（t=3.35，P＜0.05）；双荧光素酶报告实验结果提示survivin是miR-320的靶基因，寻常性银屑病皮损中miR-320 与survivin mRNA呈负相关（r2=0.634，P＜0.05）。结论 miR-320可能通过调控其下游靶基因survivin的异常表达参与寻常性银屑病皮损的形成过程。

银屑病；miR-320；survivin

［J Pract Dermatol， 2016， 9（4）：225-228］

银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病，其发病为多因素参与、多基因改变及多阶段发展的病变过程。其主要组织病理改变为角质形成细胞异常增生、角化不全和炎性细胞浸润。银屑病发病机制的研究一直是皮肤科研究的重点［1-4］。microRNA（miRNA）是一类长度为18～25 个核苷酸组成的小分子RNA，在调控基因表达中扮演着至关重要的角色，通过与靶基因作用，使其在转录后的翻译过程中被抑制或直接被降解，导致其蛋白表达水平降低，从而参与多种生物学过程［5］。其在个体生长发育、细胞增生凋亡、炎症和肿瘤等多种生理病理过程中起着十分重要的作用，而其失衡表达亦可促进多种人类疾病的发生和发展［6-10］。根据5'端序列不同，miRNA可分为多个家族，其中miR-320位于1p13.1，在上皮组织特异性表达，参与皮肤发育、稳态及功能维持，是皮肤中重要的调控因子。miR-320为survivin上游重要的调控基因。以往的研究证实，survivin 具有促进细胞增生和抑制细胞凋亡的作用， 凋亡抑制基因survivin在寻常性银屑病皮损中高表达，且参与角质形成细胞异常增生等组织病理过程［11，12］，但其具体的调控机制不清。本研究旨在检测寻常性银屑病皮损组织中miR-320和survivin的表达情况，及miR-320低表达对其下游靶基因survivin表达的影响，探讨寻常性银屑病皮损中survivin基因表达上调的原因。

1 材料和方法

1.1 临床资料

实验组标本来源于2015年3―9月在我院皮肤科就诊的40例寻常性银屑病患者，皮损组织活检后迅速冻存于液氮中；另选取40名健康人皮肤作为对照。两组在年龄、性别、取材部位相匹配。本研究获医院伦理委员会批准，所有银屑病患者与健康对照者均签署知情同意书。

1.2 材料与试剂

新鲜组织miRNA提取试剂盒（北京百泰克生物技术公司），一步法反转录试剂盒、SYBR Green I实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒（美国罗氏公司），引物（上海吉玛生物技术公司），DEPC及RNA～free水（北京索莱宝生物技术公司），Trizol、氯仿、异丙醇、无水乙醇等均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司），293T细胞（中科院上海细胞库）培养于37℃条件下、5 %CO2细胞培养箱中。

1.3 方法

1.3.1 总RNA和miRNA提取 常规Trizol试剂从银屑病组织及其正常组织中抽提总RNA，DEPC水溶解沉淀，提取步骤严格按照试剂盒说明书进行。试剂盒购自Invitrogen公司。应用微量紫外分光光度计检测总RNA的纯度和浓度。

1.3.2 RT-PCR检 测miR-320、survivin mRNA的 表达 采用一步法反转录试剂盒合成cDNA，采用20 µl反应体系，具体参见试剂盒说明书，miRNA的反转录采用加尾。SYBR green I染料法进行实时荧光定量PCR反应，取1 µl上述cDNA为模板。miR-320引物Forward 5'TCCGAAGCGGGAGAGTTGGG3'，Reverse 5'GTGCAGGGTCCGAGGT3'，内参照U6引物 Forward 5'TCCGATCGTGAAGCGTTC3'，Reverse 5'GTGCAGGGTCCGAGGT3'；Survivin引 物Forward 5'CACTGCC CCACTGAGAACGAG3'，Reverse 5'TT TCCTTTGCATGGGGTCGTC3'，内参照GAPDH引物Forward 5'GCAAATTCCATGGCACCGTCA3'，Reverse 5'GACGTACTCAGCGCCAGCATC3'。每个检测样本做3个复孔，反应条件为：95℃预热3 min；95℃12 s，60℃40 s，40个循环。miR-320和Survivin mRNA的表达水平以2-ΔΔCt表示。

1.3.3 双荧光素酶报告实验 survivin基因片段通过PCR的方法获得，基因片段上应包含于miR-320特异性结合的区域，将survivin克隆入pmirGLO载体（购自Promega公司）中，将survivin的3'UTR进行基因测序，并命名为pmirGLO-wt- survivin，将与miR-320结合位点发生突变的survivin 的3'UTR命名为pmirGLO-mut- survivin。293T细胞接种于96孔板中，使用Lipofectamine™ 2000 （购自Invitrogen公司）分别将野生型或突变型双报告载体与miR-320 mimics 或Scramble共转染入293T细胞中，转染后培养细胞24 h，之后在双报告检测仪下检测各组细胞的荧光素酶活性。

1.4 统计学方法

采 用SPSSl7.0统 计 软 件，miR-320、survivin mRNA的表达水平以均值±标准差表示，两组之间的差异比较采用t检验；应用Pearson相关性分析，分析miR-320 表达与survivin miRNA表达之间的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 银屑病皮损中miR-320 mRNA表达

实时荧光定量RT-PCR检测结果显示，寻常性银屑病患者皮损中miR-320 mRNA表达量为健康对照的（0.56±0.11）倍；结果符合正态分布，两组之间的差异有统计学意义（t=3.06，P＜0.05）。结果表明，银屑病皮损中miR-320表达水平较健康对照者皮肤组织明显下调（图l）。

2.2 survivin mRNA在寻常性银屑病皮损中的表达

RT-PCR检测结果显示，寻常性银屑病患者皮损中survivin mRNA表达量为健康对照的（2.03±0.26）倍，结果符合正态分布，经t检验，两组差异有统计学意义（t=3.35，均P＜0.05）。结果表明，银屑病皮损中survivin表达水平较健康对照者皮肤组织明显上调（图2）。

图1 RT-PCR检测寻常性银屑病患者皮损与健康对照皮肤组织中miR-320的相对表达量

图2 RT-PCR检测寻常性银屑病患者皮损与健康对照皮肤组织中survivin mRNA的相对表达量

2.3 survivin与miR-320的关系

通过生物信息学软件分析，miRNA-320与survivin的3'UTR区具有特异结合的位点（图3a）。双荧光素酶报告实验结果显示，共转染miRNA-320 mimics和pmirGLO-wt- survivin细胞组的荧光素酶活性较其他3组明显降低（P＜0.05）（图3b）。结果表明，survivin是miR-320的靶基因，miR-320可以通过与survivin的3'UTR特异结合而抑制survivin基因的表达，对其发挥负调控作用。

图3 survivin是miR-320靶基因的验证结果

2.4 寻常性银屑病皮损中miR-320和survivin mRNA表达的相关性

将40例银屑病患者皮损标本检测的miR-320和survivin mRNA表达水平进行回归分析，结果显示，二者呈现负相关，r2=0.634（图4）。与双荧光素酶报告实验结果对比，进一步说明在寻常性银屑病患者皮损中miR-320对survivin 表达起负调控作用。

图4 寻常性银屑病患者皮损中miR-320和survivin mRNA表达的相关性分析

3 讨论

银屑病为一种常见的慢性炎症性皮肤病，其全球发病率为0.5%～4.6%。因其反复发作，难以治愈，严重影响患者的生活质量，其确切病因尚未明确。目前发现多种miRNAs 分子在调节角质形成细胞增生、分化、皮肤炎症及与免疫细胞之间的相互影响等方面起着重要作用［10］，可能与银屑病的发病有一定关系。miRNA是内源性非蛋白编码单链小分子RNA，主要功能为转录后水平抑制靶基因的表达，参与基因表达的调控过程，从而在细胞分化、增生、凋亡、抗病毒及肿瘤免疫中发挥作用，miRNA对其靶基因的调节障碍会导致不同疾病的发生［4］。本研究结果显示，银屑病皮损中miR-320的表达水平较健康对照皮肤组织明显下调，与杨志波等［1］采用基因芯片技术筛选银屑病皮损组织和健康皮肤组织中差异性表达的miRNA结果一致。其他学者研究显示，miRNA-34a 和miR-26b在银屑病皮损组织存在异常表达，并且与银屑病皮损的发生相关［13，14］。提示miRNA的表达异常应该参与了银屑病皮损的发生，可能是通过多个调控通路发挥作用的。

survivin基因主要在细胞周期G2/M期表达，定位于细胞有丝分裂的纺锤体，具有促进细胞有丝分裂的作用［13］。此外，survivin基因还可以直接抑制各种凋亡途径的终末效应蛋白Caspase-3和Caspase-7，发挥抑制细胞凋亡的作用［15，16］。本研究结果显示，寻常性银屑病皮损中survivin mRNA的表达水平较健康对照皮肤组织明显上调，与国内外的研究结果均一致［17-19］。而survivin基因的高表达与银屑病皮损角质形成细胞的异常增生和分化有关，同时还参与了真皮乳头层毛细血管的增生和扩张［20］。

miRNA通过作用于其靶基因mRNA的3'UTR区来发挥调控作用。为了验证miR-320的靶基因，笔者应用生物信息学软件进行分析，结果显示miR-320 与survivin mRNA的3'UTR区存在特异性结合位点。双报告结果显示miR-320可显著降低pmirGLO-wt-survivin的荧光素酶活性，而对pmirGLO-mutsurvivin无明显影响，验证了survivin是miR-320调控的一个直接靶基因。40例银屑病患者皮损标本中miR-320和survivin mRNA表达水平相关性分析结果显示，二者表达呈现负相关。由此推测，miR-320的异常表达可能是导致survivin表达上调的原因，进而参与促进角质形成细胞增生，抑制其凋亡，参与银屑病皮损的形成过程。

［1］ 梁思， 李若虹， 王建峰， 等. 银屑病与肾脏疾病风险相关性队列研究的meta分析 ［J］. 实用皮肤病学杂志， 2016， 9（1）：8-11.

［2］ 郭志丽， 高志祥， 陈琢， 等. FoxM1在寻常性银屑病患者皮损中的表达 ［J］. 实用皮肤病学杂志， 2015， 8（1）：3-5.

［3］ 樊卓， 覃静净， 王丹丹， 等. 窄谱中波紫外线对寻常性银屑病患者外周血干扰素诱导的T细胞α趋化因子表达的影响 ［J］. 实用皮肤病学杂志， 2015， 8（2）：92-94.

［4］ 杨志波， 唐雪勇. 银屑病差异表达microRNA与靶基因及基因功能调控网络的研究 ［J］. 中国中西医结合皮肤性病学杂志， 2012，11（2）：69-73.

［5］ Ying SY. Micro RNA protocols ［M］. Humana Press Inc， 2008：1-13.

［6］ Pellegrino L， Jacob J， Roca-Alonso L， et al. Altered expression of the miRNA processing endoribonuclease Dicer has prognostic significance in human cancers ［J］. Expert Rev Anticancer Ther， 2013，13：21-27.

［7］ Pereira DM， Rodrigues PM， Borralho PM， et al. Delivering the promise of miRNA cancer therapeutics ［J］. Drug Discov Today，2013， 18：282-289.

［8］ Asrih M， Steffens S. Emerging role of epigenetics and miRNA in diabetic cardiomyopathy ［J］. Cardiovasc Pathol， 2013， 22：117-125.

［9］ Akbari Moqadam F， Pieters R， den Boer ML. The hunting of targets：challenge in miRNA research ［J］. Leukemia， 2013， 27： 16-23.

［10］ Ishida M， Selaru FM. miRNA-Based Therapeutic Strategies ［J］. Curr Anesthesiol Rep， 2013， 1： 63-65.

［11］ 江从军， 刘贞富， 徐秋梅. 生存素在寻常型银屑病皮损中的表达［J］. 中国麻风皮肤病杂志， 2007， 23（5）：391-392.

［12］ 孙波， 徐雨. 银屑病皮损中Survivin、VEGF和Ang-2的表达 ［J］. 中国麻风皮肤病杂志， 2012， 28（5）：320-323.

［13］ 陈春丽， 赵宗峰， 刘新梅， 等. 寻常型银屑病患者皮损中miRNA-34a及其靶基因Notch1的表达及意义 ［J］. 皮肤性病诊疗学杂志，2015， 22（6）：423-427.

［14］ Cheung L， Fisher RM， Kuzmina N， et al. Psoriasis Skin Inflammation-Induced microRNA-26b Targets NCEH1 in Underlying Subcutaneous Adipose Tissue ［J］. J Invest Dermatol，2016， 136（3）：640-648.

［15］ 陈涛， 田伏洲. Survivin基因与肿瘤研究进展 ［J］. 中国普外基础与临床杂志， 2002， 9（5）：364-366.

［16］ 蒋伟忠. Survivin在胃癌组织中的表达和意义及其与p53、Bcl-2及Bax蛋白表达的相关性研究 ［D］. 福州： 福建医科大学， 2004.

［17］ Bowen AR， Hanks AN， Murphy KJ， et a1. Proliferation， apoptosis，and surviving Expression in keratinocytic neoplasms and hyperplasias ［J］. Am J Dermatopathol， 2004， 26（3）：177-181.

［18］ Markham T， Mathews C， Rogers S， et a1. Downregulation of the inhibitor of apoptosis protein survivin in keratinocytes and endothelial cells in psoriasis Skin following infliximab therapy ［J］. Br J Dermatol， 2006， 155（6）：1191-1196.

［19］ Abdou AG， Hanout HM. Evaluation of survivin and NF-kappaB in psoriasis， anImmunohistochemical study ［J］. J Cutan Pathol， 2008，35（5）：445-451.

［20］ 许功军， 蔡绥勃. miR-203及其下游靶基因p63、生存素在银屑病皮损中的表达 ［J］. 中华皮肤科杂志， 2015， 48（4）：237-239.

Expressions of miR-320 and its downstream target gene survivin in psoriatic lesions

WEI Yan-ping，ZHANG Ru-xing，SHI Si-ji，et al
Department of Dermatology， Jiaozuo People's Hospital， Jiaozuo 454002， China

Objective To measure the expressions of miR-320 and its downstream target gene survivin in psoriatic vulgaris lesions. Methods Tissue specimens were collected from lesions of 40 patients with psoriasis vulgaris and normal skin of 40 healthy human controls. Real-time PCR was performed to detect miR-320 and survivin mRNA expressions. Luciferase reporter assay was used to evaluate whether survivin is a direct target of miR-320. Statistical analysis was carried out by t-test for intergroup comparisons and by Pearson correlation analysis for the analysis of correlation between miR-320 and survivin expressions in psoriasis vulgaris lesions. Results Compared with the normal control skin， psoriasis vulgaris lesions showed significantly decreased mRNA expression level of miR-320 （0.561±0.1l， t=3.06， P＜0.05）， but increased mRNA expression level of survivin （2.034±0.26， t=3.35， P＜0.05）. The mRNA expression level of miR-320 showed a significantly negative correlation with that of survivin （r2=0.634， P＜0.05）. Luciferase reporter assay showed that survivin was a direct target of miR-320. Conclusion MiR-320 might participate in the development of psoriatic lesions via targeting the regulation of its downstream target survivin.

Psoriasis；MiR-320；Survivin

R758.63

A

1674-1293（2016）04-0225-04

2015-11-25

2016-01-19）

（本文编辑 耿建丽）

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20160401

454002焦作，焦作市人民医院皮肤性病科（卫艳萍，张如幸，史四季， 刘秀琴， 赵林栋）

卫艳萍，主治医师，研究方向：皮肤外科

E-mail： weiyanping1977716@126.com

赵林栋，E-mail： jz_zld@163.com