盐酸林可霉素分子印迹膜电化学传感器的制备及应用

申志国， 黄碧霞， 陈鹏瑀， 王 静， 修 荣， 刘 静*

(1.河北医科大学药学院，河北石家庄 050017;(2.河北省邯郸市峰峰牛儿庄矿社区管理处医院，河北邯郸 056201)

盐酸林可霉素为常用抗生素，适用于由革兰氏阳性菌引起的疾病治疗[1,2]。临床上可用来治疗葡萄球菌属、化脓性链球菌、肺炎链球菌及厌氧菌所致的呼吸道感染、皮肤软组织感染、女性生殖道和盆腔感染及腹腔感染等疾病，其含量检测方法主要有微生物效价法[3]和高效液相色谱法[4]。但这两种方法都存在着操作繁琐、成本较高、检验周期长等不足。目前，采用高效毛细管电泳(HPCE)法测定盐酸林可霉素的含量也有文献报道[5]。

本文利用分子印迹技术，制备了盐酸林可霉素印迹膜传感器，建立了测定盐酸林可霉素含量的电化学分析新方法。该方法的显著特点是传感器制备简单、成本低廉、测定准确、抗干扰能力强，且对药物的高度识别性优于其他测量方法。可应用于临床、制药、环境监测等领域盐酸林可霉素含量的测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI660C型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)，采用三电极体系：玻碳电极(GCE,Φ=4 mm)或修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极。超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。

盐酸林可霉素原料药(纯度99%，华北制药集团)，邻苯二胺(o-PD)，过硫酸铵，N，N′-亚甲基双丙烯酰胺(MBA, 阿拉丁试剂)，其余试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。

盐酸林可霉素注射液(批号：1311037，山东方明药业集团股份有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1玻碳电极的预处理在鹿皮上将GCE依次用1.0、0.3、0.05 μm的Al2O3粉末抛光后，依次用HNO3-丙酮(体积比为1∶1)溶液和二次蒸馏水各超声清洗5 min，将电极放入5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](含0.2 mol/L KCl )溶液中，在-0.3～0.7 V电位范围内，进行循环伏安(CV)法扫描至曲线稳定，将电极取出，用二次蒸馏水洗净，备用。

1.2.2印迹与非印迹修饰电极的制备以盐酸林可霉素(0.01 mol/L)为模板分子，o-PD(0.03 mol/L)为功能单体，MBA(0.02 mol/L)为交联剂，过硫酸铵(0.08 mol/L)为引发剂，进行电聚合反应。采用三电极体系，在-0.3～0.7 V电位范围内进行CV扫描，扫描速率为50 mV/s，电聚合20圈。将电极取出置于正十二硫醇溶液中浸泡10 h后，用甲醇溶液洗脱15 min，即得盐酸林可霉素印迹膜(MIP)电极[6]。将电极保存在pH=6.98磷酸盐缓冲溶液(PBS)中备用。非印迹(NMIP)电极的制备除不加模板分子外，其余步骤同上。

1.2.3检测方法在反应池中，以5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](含0.2 mol/L KCl )溶液为底液，加入盐酸林可霉素溶液，插入三电极体系，进行差分脉冲伏安(DPV)法测定。测完一个浓度的样品后，将电极在甲醇溶液中洗脱，除去盐酸林可霉素分子，再进行下次测定。

2 结果与讨论

2.1 不同电极的循环伏安表征

图1 不同电极的的循环伏安图Fig.1 Cyclic voltammograms of different electrodes a:bare GCE;b:electrode after removal of lincomycin;c:imprinted polymer membrane electrode.

图1为裸GCE、洗脱后和未洗脱印迹膜的三种电极在5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](含0.2 mol/L KCl )溶液中的CV图。由图1可见，未洗脱的印迹膜电极(图1曲线c)氧化还原峰消失为一直线，这说明在电极表面聚合了一层致密均匀的绝缘膜,阻碍了电极表面的电子传递，导致电极几乎无响应信号。洗脱模板分子后的电极(图1曲线b)，由于形成了印迹膜的空穴，有利于其在电极表面发生氧化还原反应，可以作为K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] 溶液的扩散通道，因此有明显的峰电流。但由于模板分子不可能完全除去，故峰电流比裸GCE(图1曲线a)低。

图2 不同的电极在5 mmol/L的K4[Fe(CN)4]/K3[Fe(CN)6]溶液(pH=8.0)中的交流阻抗图Fig.2 Electrochemical impedance spectra of different electrodes in 5 mmol/L K4[Fe(CN)4]/K3[Fe(CN)6] solution (pH=8.0) a.bare glassy carbon electrode;b.after removal of the lincomycin;c.after interaction with 1.892×10-7 mol/L lincomycin;d.after interaction with 3.628×10-7 mol/L lincomycin;e.NMIP-electrode.

2.2 不同修饰电极的交流阻抗

不同电极在5 mmol/L K4[Fe(CN)4]/K3[Fe(CN)6] (含0.2 mol/L KCl)溶液中的交流阻抗(EIS)图见图2。EIS图上半圆直径的大小，反映了印迹膜的阻抗大小。裸GCE(图2曲线a)的EIS半圆直径非常小，表明对K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]在电极上的氧化还原反应有较小的阻抗。非印迹电极(图2曲线e)的表面由于形成了致密的聚合物膜，导致铁离子很难扩散到电极表面，氧化还原反应很难进行，电流阻抗值很大，EIS半圆直径最大。洗脱模板分子后的电极(图2曲线b)，由于聚合膜内留下多个“空穴”，铁离子可以通过“空穴”在电极表面发生氧化还原反应，故其半圆直径远小于非印迹电极(图2曲线e)。将去除模板后的电极置于林可霉素浓度分别为1.892×10-7mol/L和3.628×10-7mol/L的PBS中，林可霉素重新占据膜空穴。随着浓度的增加，印迹膜的“空穴”数减少，交流阻抗增加，半圆直径增大(图2曲线c和d)。EIS图表明分子印迹膜表面状态的变化结果与CV图一致。

2.3 洗脱液及洗脱时间的选择

分别考察了甲醇、甲醇-乙酸(体积比为9∶1、8∶2、7∶3、6∶4)溶液对模板分子的去除效果。结果发现，使用甲醇-乙酸溶液洗脱，电极聚合物膜极易损坏。而用甲醇洗脱时，取得了较好的洗脱效果，CV曲线峰形规整，洗脱15 min后CV曲线不再发生变化，表明模板分子基本除去。因此实验选择甲醇为洗脱剂，洗脱时间为15 min。

2.4 交联剂比例的选择

本实验固定林可霉素、o-PD物质的摩尔比为1∶3，交联剂MBA分别为1、2、3摩尔时，采用CV法考察了三种比例的分子印迹膜的性能。结果表明，交联剂用量为3摩尔时，模板分子难以洗脱。当交联剂用量为1摩尔时，聚合物在电极上成膜稳定性较差。当林可霉素、o-PD及MBA摩尔比为1∶3∶2时聚合膜骨架稳定，且膜板分子易于洗脱。故选此比例溶液为电极聚合液。

2.5 缓冲溶液pH值的选择

固定林可霉素的浓度为0.01 mol/L，配制pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的PBS，考察酸度对电极聚合膜性能的影响。实验表明溶液酸、碱性过强时，膜结构易遭到破坏，导致膜的稳定性和选择性下降。且酸性过强时导致模板分子与o-PD所形成的氢键不稳定。而当pH值为7.0时，氧化还原峰形较好，且响应电流最大，因此选择pH=7.0的PBS为检测溶液。

2.6 孵化时间确定

将洗脱好的印迹膜电极置于1.0×10-8mol/L 林可霉素溶液中，分别浸泡7、8、9、10、11 min，通过DPV法考察峰电流与孵化时间的关系。结果发现，孵化时间由7 min增加到到10 min时，峰电流不断上升，但11 min时峰电流下降。表明电极表面空穴在10 min时基本被模板分子占据，达到结合平衡。故测定时的孵化时间选择为10 min。

2.7 线性方程、标准曲线与检出限

图3 不同浓度林可霉素的差分脉冲伏安图Fig.3 Differential pulse voltammograms of different lincomycin concentrations a-u:lincomycin concentrations(μmol/L)：0.066，0.100，0.189，0.277，0.363，0.447，0.530，0.612，0.692，0.771，1.00，1.20.

图3为电极在不同浓度林可霉素溶液中的DPV图。结果表明，在6.604×10-8～1.204×10-6mol/L浓度范围内，峰电流与林可霉素浓度呈良好的线性关系，其线性回归方程为：Ip(μA)=-15.103c+0.00004，线性相关系数r=0.9959，检出限为5.0×10-9mol/L。

2.8 印迹膜电极的干扰试验

采用DPV法，以峰电流的变化值小于±5%作为判定是否干扰电极测定的标准[7],考察了干扰物(大于林可霉素溶液浓度1 000倍的AlCl3、MgCl2、CaCl2、Na2SO4、KNO3、(NH4)2SO4、ZnCl2、环糊精)对测定的影响。结果表明，上述物质对测定影响很小。但浓度大于林可霉素 100倍的氯霉素、氨基比林和阿奇霉素对测定有一定影响。

2.9 重现性与稳定性

电极在林可霉素浓度为5.0×10-7mol/L 的溶液中平行测定5次，其DPV峰电流的相对标准偏差(RSD)为3.2%，表明电极具有良好的重现性。电极放置10 d后，印迹电极的峰电流降至90%，表明该印迹电极具有良好的稳定性。

3 样品分析及回收率

3.1 样品分析

准确吸取盐酸林可霉素注射液(标示量每支0.6 g/2mL),用5 mmol/L K4[Fe(CN)4]/K3[Fe(CN)6]的PBS稀释成浓度为2.170×10-7mol/L的溶液。将上述溶液进行DPV法测定，平行测定5次，计算盐酸林可霉素浓度，平均值为2.083×10-7mol/L，占注射剂标示量96.0%,RSD为0.097%。

3.2 回收率测定

在最佳测定条件下，加入一定浓度的盐酸林可霉素标准溶液进行回收实验，平行测定5次，取其平均值，回收率在95.9%～103.6%之间，结果见表1。

4 结论

以林可霉素为模板分子，邻苯二胺为功能单体，N，N′-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，采用电聚合法成功制备了林可霉素分子印迹膜电极。该电极具有制作简便，灵敏度高，稳定性强，选择性好等特点，可用于临床、制药、环境监测等领域林可霉素含量的测定。

表1 回收率测定结果