环糊精修饰毛细管胶束电动色谱同时分离检测橙皮苷和柚皮苷对映体

孙照霞， 苏 慧， 丛日琳,2， 徐 伟， 褚克丹， 余丽双*

(1.福建中医药大学药学院，福建福州 350122;2.荣成市中医院，山东威海 264300)

橙皮苷(Hesperidin)和柚皮苷(Naringin)均属于黄酮类化合物，在C-2位存在手性中心，具有旋光性，广泛存在于芸香科柑橘属植物的果肉和果皮中，在临床上具有抗炎[1]、抗癌[2]、抗氧化[3]、神经保护[4]、改善糖尿病[5]等多种生理活性，具有较高的药用价值。目前，文献报道橙皮苷或柚皮苷对映体拆分方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[6,7]和毛细管电泳法(CE)[8 - 13]。相较于HPLC，CE具有分离能力强，快速，样品、溶剂和手性选择剂用量少，经济环保，可选择和改变的手性选择剂种类多等优点而被广泛应用于手性拆分。采用环糊精修饰手性毛细管胶束电动色谱法(CD-MEKC)，如CE中添加环糊精和胆酸盐双手性选择剂，可提高CE手性拆分能力[14,15]。但未见利用CD-MEKC同时分离检测橙皮苷和柚皮苷对映体的报道。

本文采用羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD修饰手性胶束毛细管电动色谱法同时分离检测橙皮苷和柚皮苷对映体。在优化分离条件下，橙皮苷和柚皮苷对映体在9 min内得到完全分离，将该方法应用于中药制剂胃苏颗粒中橙皮苷和柚皮苷对映体的测定，回收率为86.0%～113.2%。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

P/ACE MDQ毛细管电泳仪(美国，Beckman Coulter公司)，附二极管陈列检测器(DAD)；未涂层熔融石英毛细管(63.5 cm×75 μm i.d.,有效长度52 cm，美国Beckman coulter公司)；雷磁pHS-3C型精密酸度计(上海精密科学仪器有限公司)；XS105电子分析天平(梅特勒-托利多国际股份有限公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。

橙皮苷标准品(批号:110721-201014，中国药品生物制品检定所)；柚皮苷标准品(批号：110722-200309，中国药品生物制品检定所)。胆酸钠(SC，北京百灵威科技有限公司)；羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD，美国 SIGMA-ALDRICH)；硼砂、Na2HPO4、NaH2PO4、NaOH(国药集团化学试剂有限公司)；其他试剂均为分析纯，所用水为Milli-Q超纯水。

胃苏颗粒(批号：12031101，扬子江药业集团)。

1.2 对照品及供试品溶液配制

精密称取橙皮苷和柚皮苷的对照品，分别用甲醇溶解配成浓度为1 mg/mL的溶液，冷藏备用，使用时用超纯水稀释成所需浓度即可。精密称取研细的胃苏颗粒药品粉末2 g，置于具塞锥形瓶中，用20 mL甲醇超声提取30 min，静置，过滤，残渣同法再操作一次，合并两次滤液，水浴浓缩至3～4 mL，甲醇定容至10 mL。使用前均需用0.22 μm微孔滤膜过滤。

1.3 实验方法

未使用过的毛细管分别用1 mol/L的HCl，超纯水，1 mol/L的NaOH溶液，超纯水，运行缓冲液各冲洗20 min。使用过的毛细管分别用超纯水，0.1 mol/L的NaOH，超纯水，运行缓冲液各冲洗5 min即可。两次进样间用运行缓冲液冲洗2 min。所有溶液在电泳前均需用0.22 μm聚乙烯滤膜过滤。

2 结果与讨论

2.1 电泳分离检测条件的优化

图1 HP-β -CD浓度对橙皮苷和柚皮苷对映体拆分的影响Fig.1 Effect of HP-β -CD concentration on the chiral separation of hesperidin and naringin Running buffer:10 mmol/L NaB4O7+60 mmol/L SC+different concentrations of HP-β -CD:(a)20 mmol/L;(b)25 mmol/L;(c)30 mmol/L;(d)35 mmol/L;separation voltage:25 kV;hydrodynamic injection:0.5 psi×4s;detection wavelength:214 nm;temperature:25 ℃.1,1′:Hesperidin;2,2′:Naringin.

2.1.1手性选择剂的选择及浓度优化实验考察了α，β，γ-环糊精及其衍生物HP-β-CD和SC手性胶束对橙皮苷和柚皮苷对映体拆分效果的影响。实验发现HP-β-CD对橙皮苷对映体拆分效果最佳，且可达到基线分离；SC手性胶束对柚皮苷对映体拆分效果最佳，但单独使用它们均无法实现同时拆分橙皮苷和柚皮苷对映体。进一步考察了采用HP-β-CD和SC胶束双手性选择剂对橙皮苷和柚皮苷对映体拆分效果的影响，实验结果表明由于HP-β-CD和SC胶束的协同作用，橙皮苷和柚皮苷对映体均能得到拆分。

实验考察双手性选择剂浓度对分析物拆分效果的影响。考察了SC浓度为50、55、60、65、70 mmol/L时对分析物拆分效果的影响，结果表明60 mmol/L SC拆分效果最佳。考察HP-β-CD浓度在20～35 mmol/L范围内对拆分效果的影响，结果如图1。随着HP-β-CD浓度的增大，分析时间缩短，柚皮苷对映体的分离度变大，但橙皮苷对映体的分离度变小；当浓度大于30 mmol/L时，柚皮苷对映体分离度降低。综合考虑橙皮苷对映体和柚皮苷对映体的分离情况，选择30 mmol/L为HP-β-CD最佳浓度。

2.1.2缓冲液pH的优化缓冲液pH的大小是影响分离的重要因素之一，pH的变化会影响电渗流的大小，改变手性选择剂和分析物的带电情况，进而影响其迁移率及分离度。实验以20 mmol/L NaH2PO4-100 mmol/L NaOH为背景缓冲液，考察了pH在8.0～9.5范围内对分离的影响。结果表明，随着pH的增大，分析物的分离度变大，迁移时间缩短；当pH大于9.0时，橙皮苷对映体的分离度变小。综合考虑分离度及分析时间的影响，选择20 mmol/L NaH2PO4-100 mmol/L NaOH(pH=9.0)为最佳背景缓冲液。

2.1.3有机添加剂的选择有机添加剂主要的作用是抑制电渗流，延长迁移时间，增加分析物的溶解度，从而改善分离度。为了进一步提高其分离度，实验考察了不同有机添加剂对分离的影响，分别考察了乙腈、甲醇、异丙醇的影响。实验结果表明，当加入乙腈或异丙醇时，随着其浓度的增大，柚皮苷对映体的峰形展宽且分离度下降；而甲醇则可以改善柚皮苷对映体的分离，考察了甲醇在2%～10%(V/V)范围对其分离的影响，实验发现添加3%(V/V)甲醇时，高浓度的柚皮苷对映体亦能得到基线分离。

图2 橙皮苷和柚皮苷混合标准品的分离谱图Fig.2 Electropherogram of the standard mixture solution of hesperidin and naringin Running buffer:60 mmol/L SC+30 mmol/L HP-β -CD +20 mmol/L NaH2PO4-100 mM NaOH(pH=9.0，97%(V/V))+3%(V/V)methanol;other conditions as in Fig.1.

2.1.4分离电压的优化实验考察了在20～26 kV范围内，分离电压对分离效果的影响。当分离电压低于25 kV时，迁移时间延长，峰形展宽；分离电压大于25 kV时，柚皮苷对映体不能达到基线分离。综合考虑分离度、峰形和分析时间，选择25 kV为最佳分离电压。

综上所述，优化条件为：60 mmol/L SC+30 mmol/L HP-β-CD+20 mmol/L NaH2PO4-100 mmol/L NaOH(pH=9.0，97%(V/V))+3%(V/V)甲醇为运行缓冲液，分离电压25 kV。在上述条件下橙皮苷和柚皮苷对映体标准混合液的电泳图如图2。

2.2 方法学考察

2.2.1精密度试验在上述优化的条件下，将一定浓度的橙皮苷和柚皮苷混合标准液在1 d内连续进样5次，计算各对映体的峰面积和迁移时间的相对标准偏差(RSD)，测得橙皮苷1、橙皮苷1′、柚皮苷2和柚皮苷2′的迁移时间和峰面积的RSD分别为0.43%、0.46%、0.54%、0.57%和3.5%、1.0%、2.7%、3.7%。

2.2.2线性关系及检测限在优化条件下，对一系列不同浓度的橙皮苷和柚皮苷混合标准液进行分析测定，以电泳谱图的峰面积(Y)分别对橙皮苷和柚皮苷对映体浓度(X，μg/mL)进行回归分析；由于橙皮苷和柚皮苷为消旋体，故其异构体浓度可视为其浓度的1/2)，并根据三倍信噪比(S/N=3)确定其检测限。所得的线性回归方程、线性相关系数及检测限如表1所示。

表1 橙皮苷和柚皮苷对映体线性回归方程和检测限

图3 胃苏颗粒剂提取物的毛细管电泳分离谱图Fig.3 Electropherograms of the extract of Weisu granules(a) and the above extract + the accurate amount of analytes(b) The separation conditions as in Fig.2.

2.2.3稳定性试验精密称定同一批号的胃苏颗粒粉末，按1.2节制备供试品溶液，室温条件下每隔4 h进样测定橙皮苷和柚皮苷对映体的峰面积变化，经计算，在24 h内各对映体峰面积的RSD均小于5%，说明样品的稳定性较好。

2.3 样品分析及回收率试验

取同一批胃苏颗粒制剂，按1.2节制备供试品溶液，在最佳电泳条件下，测定样品中橙皮苷和柚皮苷对映体的含量，结果如表2所示。实际样品的毛细管电泳图见图3。为验证方法的可靠性，对胃苏颗粒样品进行加入回收率试验，结果如表2所示，橙皮苷和柚皮苷对映体的回收率在86.0%～113.2%之间。

表2 胃苏颗粒中橙皮苷和柚皮苷对映体的含量及回收率试验结果(n=3)

3 结论

本文建立了一种同时分离检测胃苏颗粒中橙皮苷和柚皮苷对映体的环糊精修饰毛细管胶束电动色谱法(CD-MEKC)。实验发现单独采用一种手性选择剂如HP-β-CD或SC均无法同时拆分橙皮苷和柚皮苷对映体；而采用双手性选择剂，由于HP-β-CD和SC手性胶束的协同作用，橙皮苷和柚皮苷对映体得到有效分离。所建立的方法简单快速，分离度好，精密度高，有望为含橙皮苷和柚皮苷对映体的复杂样品的定量检测提供新方法。