固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定枸杞中9种红色合成色素

粟有志，刘 俊，李艳美，马志愿，雷红琴，罗 琼

(1.伊犁出入境检验检疫局综合技术服务中心，新疆伊宁 835000；2.新疆出入境检验检疫局技术中心，新疆乌鲁木齐 830063；3.伊犁师范学院化学与生物科学学院，新疆伊宁 835000)

合成色素具有色泽鲜艳、着色力强、色调多样等优点，但它也存在毒性、致泻性和致癌性等缺点[1]。世界各国对合成色素的使用范围和限量都做出了严格的规定，我国国家标准(GB 2760-2014)《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》仅允许苋菜红、胭脂红、赤藓红、柠檬黄等11种合成色素在食品中限量使用[2]。优质枸杞呈现自然红色，价格较高，是我国重要的食药材，为防止不法商家在劣质枸杞中添加合成色素以次充好、以坏充优，建立枸杞中合成色素的检测方法意义重大。

国内外对合成色素的检测方法主要有分光光度法[3,4]、薄层色谱法[5,6]、毛细管电泳[7,8]、脉冲极谱法[9]、液相色谱法[10 - 12]和液相色谱-质联用法[13 - 16]。其中，分光光度法和脉冲极谱法一般适合用于较为简单的样品，对复杂样品无法进行准确定性定量；薄层色谱法、毛细管电泳、液相色谱法不能对目标分析物进行确证；液相色谱-质谱法具有灵敏度高，抗基体干扰能力强等优点，已成功应用于食品中合成色素的测定。采用液相色谱-质谱法分析合成色素，常见于糖果、饮料、红酒等样品，而枸杞中合成色素的检测方法鲜有报道。本文以4种常用食品添加剂(诱惑红、胭脂红、赤藓红、苋菜红)和5种工业染料(酸性红1、酸性红9、酸性红14、酸性红52、酸性红73)为研究对象，采用固相萃取前处理降低样品基质干扰，成功地建立了枸杞中上述9种红色合成色素的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)分析方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

Agilent 1260-6460A高效液相色谱-串联质谱仪(美国，Agilent公司)，配有电喷雾离子源(ESI)；EYELA MMV-1000 W振荡器(日本，东京理化公司)；N-EVAP-112水浴氮吹仪(美国，Organomation公司)；Sigma3-18K台式冷冻离心机(美国，Sigma公司)；T18基本型均质器和MS3型涡旋振荡器(德国，IKA公司)。Strata-X-AW固相萃取柱(60 mg/3mL，Phenomenex公司)；Oasis HLB、Oasis WAX、Oasis MAX固相萃取柱(均为60 mg/3mL，Waters公司)；Plexa PAX固相萃取小柱(60 mg/3mL，Agilent公司)。

9种色素标准品均购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，纯度均大于98.0%。 准确称取标准品10 mg(精确至0.01 mg)于10 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，配成质量浓度为1 000 mg/L的标准储备液，储存于4 ℃冰箱中备用。乙腈、丙酮、甲酸、乙醇、甲醇均为色谱纯，其他试剂为分析纯。实验用水为Milli-Q超纯水。

实验所用枸杞样品来自市场随机采样和送检样品。

1.2 样品前处理

取代表性样品500 g，置于混合研磨仪中充分粉碎，密封，储存于4 ℃冰箱中保存备用。称取试样1 g(精确至0.01 g)于50 mL具塞离心管中，加入20 mL乙腈-甲醇(5∶5，V/V)，10 000 r/min均质1 min，10 000 r/min离心10 min，上清液备用。Oasis WAX固相萃取柱依次用3 mL甲醇、3 mL水预先活化；吸取上清液10 mL于试管中在40 ℃水浴下氮吹至干，用6 mL水分两次超声溶解残渣，将溶解液全部转移至Oasis WAX柱中，弃去流出液，依次用3 mL水、3 mL甲醇淋洗小柱，弃去淋洗液，于负压下抽干萃取柱，最后用6.0 mL氨水-甲醇(5∶95,V/V)洗脱，收集洗脱液于15 mL试管中，于40 ℃水浴下氮吹至干，用1 mL乙腈-水(1∶9,V/V)复溶。将复溶液转移至1.5 mL离心管中，15 000 r/min离心10 min，上清液供HPLC-ESI-MS/MS测定。

1.3 液相色谱与质谱条件

1.3.1液相色谱条件色谱柱：Zorbax Eclipse Plus C18柱(100×3.0 mm,1.8 μm)；柱温：30 ℃；进样量：10.0 μL；流动相：10 mmol/L乙酸铵溶液(A)和乙腈(B)，流速0.3 mL/min；梯度洗脱程序：0～1.0 min，10%B；1.0～5.5 min，10%～90%B；5.5～7.5 min，90%B；7.51～12.0 min，90%B。

1.3.2质谱条件电离模式：负离子源模式(ESI-)；多重反应监测模式(MRM)检测；雾化气、鞘气、碰撞气均为高纯氮气；干燥气温度：350 ℃；干燥气流量：9.0 L/min；鞘气温度：250 ℃；鞘气流速：11.0 L/min；毛细管电压:3.5 kV。9种色素的监测离子对、碰撞能力、碎裂电压等详见表1。

表1 9种红色合成色素的质谱分析参数

CE:collision energy;F:fragmentor voltage;* quantitative ion.

2 结果与讨论

2.1 仪器条件的优化

9种红色合成色素均为弱酸性化合物，适合于负离子扫描模式。配制9种色素单一标准溶液；在不接色谱柱的条件下进行母离子全扫描，确定准分子离子峰。参照欧盟指令657/2002/EEC决议中有关规定，本文选择离子丰度最高、本底干扰最小的两个离子对作为特征离子对，其中信号较大的离子对作为定量离子。基于优化结果建立的质谱条件参数详见表1。

比较不同浓度的甲酸、乙酸铵、甲酸-乙酸铵水溶液、纯水所组成的无机相，乙腈、甲醇组成的有机相系统。通过不同无机相与有机相的组合比较分析发现，乙腈-10 mmol/L乙酸铵水溶液为流动相时，9种色素的离子化效益较好。通过设定梯度洗脱程序，9种色素均可获得较好的分离度和响应信号。

2.2 前处理条件的优化

2.2.1提取溶剂的选择9种色素均为极性化合物，实验比较了水、甲醇、乙腈、丙酮、乙醇5种极性溶剂对目标物的提取效率。结果如图1。结果发现，乙腈-甲醇(5∶5,V/V)提取时9种色素的提取回收率均可到达检测要求。

2.2.2固相萃取柱及洗脱剂的选择取9种色素的混合标准溶液3 mL分别过60 mg/3mL的Oasis WAX、Plexa PAX、Strata-X-AW、Oasis MAX、Oasis HLB固相萃取柱，收集流出液，供HPLC-MS/MS测试。结果表明，带有阴离子交换基团的Oasis WAX、Strata-X-AW、Plexa PAX、Oasis MAX均可以对9种色素完全吸附。

分别采用氨水-甲醇(5∶95,V/V)、甲酸-甲醇(5∶95,V/V)、盐酸-甲醇溶液(0.5∶99.5,V/V)、乙腈、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯各10 mL为洗脱液对Oasis WAX、Strata-X-AW、Plexa PAX、Oasis MAX固相萃取柱进行洗脱。结果发现，10 mL氨水-甲醇可将Oasis WAX和Strata-X-AW固相萃取柱吸附的色素完全洗脱。在枸杞样品中添加混合标准溶液，进一步对比Oasis WAX和Strata-X-AW固相萃取对样品的净化效果，结果发现，二者净化样品时，9种色素的实验回收率均可满足分析的要求，但Oasis WAX固相萃取柱净化，样品的基质干扰相对较小。故本文选择Oasis WAX固相萃取柱净化样品。

以氨水-甲醇(5∶95,V/V)为洗脱液，进一步优化洗脱液的用量，每2 mL洗脱液收集一次，共收集12 mL。分别计算各段流出液中色素的回收率。结果表明，洗脱液体积大于6 mL时回收率在80%～110%的色素的个数不再增加，平均回收率也无明显提高。故本文最终选择6 mL氨水-甲醇进行洗脱。空白样品和添加浓度为1倍定量限(LOQ)的9种红色合成色素的空白样品，经提取和净化后的MRM色谱图见图2。

2.3 方法的线性关系、检出限和定量限

实验发现，样品基质对9种分析色素均有一定的抑制作用，本文采用基质匹配标准曲线以消除样品基质效应。阴性样品按照1.2节条件净化后，将混合标准溶液适当稀释，配成合适浓度的基质匹配标准曲线溶液。以峰面积(y)对合成色素的质量浓度(x)作线性回归，绘制标准曲线，9种色素在枸杞基质中的相关系数(r2)均大于0.992。以信噪比(S/N)≥3确定方法的检出限(LOD)，其范围为0.003～0.900 mg/kg；以S/N≥10确定方法的定量限(LOQ)，其范围为0.01～3.00 mg/kg。9种红色合成色素的保留时间、线性关系、检出限和定量限详见表2。

表2 9种红色合成色素的保留时间、线性关系、检出限和定量限

(续表2)

2.4 方法的准确度和精密度

选择枸杞空白样品，以1、2、10 倍LOQ为加标水平进行回收率实验。添加中间混合标准溶液的样品，静置30 min，待色素被样品充分吸收后，按照1.2节方法和1.3节条件进行前处理和仪器测定，每个水平重复6次。实验回收率和相对标准偏差见表3。从表3可以看出，9种红色合成色素的回收率为82.4%～99.5%，相对标准偏差为4.6%～16.1%。

表3 9种红色合成色素的添加回收率和相对标准偏差(n=6)

2.5 样品测定

利用本方法对市售的50份枸杞样品进行9种红色合成色素的测定，结果均未检出目标分析物。将阴性样品浸泡在诱惑红水溶液中过夜，捞出，置于烘箱中65 ℃烘干，获得含有诱惑红的枸杞阳性样品，自制阳性样品色谱图见图3。

3 结论

本文通过对仪器参数、提取溶剂、固相萃取条件的优化，建立了枸杞中酸性红1、酸性红9、诱惑红等9种红色合成色素的液相色谱-串联质谱分析方法。该方法定量限、回收率和精密度均满足痕量分析的要求，可为枸杞中此类物质的风险监控提供可靠的技术支持。