Fe(Ⅲ)-磺基水杨酸体系共振散射法测定肝素钠

翟好英，唐 卫

(内江师范学院化学化工学院，四川内江 641112)

肝素钠是从猪或牛的肠粘膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属粘多糖类物质。它作为世界上最有效和临床用量最大的抗凝血药物，主要应用于心脑血管疾病和血液透析治疗。此外，肝素钠还有降血脂、抗中膜平滑肌细胞增生、促进纤维蛋白溶解等多种生物活性和临床用途。因此，对实际样品中肝素钠含量的分析研究有着较重要的意义。

目前测定肝素钠的常见方法主要有分光光度法[1,2]、伏安法[3,4]、荧光法[5]、共振散射法[6，7]。本文研究发现，在pH=4.5的B-R缓冲液中，Fe(Ⅲ)与磺基水杨酸反应可生成紫红色配合物，该体系中加入肝素钠后在静电引力作用下结合形成离子缔合物，从而使得体系在257 nm和342 nm处的共振散射信号明显降低。且随着肝素钠浓度的增大，体系的共振散射信号△I随之减弱。据此建立了一种测定肝素钠的共振散射法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F-4600型荧光分光光度计(日本,日立公司)，测定参数：激发和发射狭缝宽度均为5.0 nm，光电倍增管(PMT)电压为400 V。pHS -3E型pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)。

肝素钠标准溶液：准确称取0.1000 g肝素钠，用超纯水溶解，定容至100 mL容量瓶，得1.0 mg/mL 肝素钠储备液，使用时稀释为50.0 μg/mL工作液。5-磺基水杨酸溶液：准确称取0.6350 g 5-磺基水杨酸，用超纯水溶解定容至100 mL，得0.010 mol/L 5-磺基水杨酸溶液。B-R缓冲溶液：用0.040 mol/L磷酸、硼酸和乙酸配制而成，使用时用0.20 mol/L NaOH溶液在pH计上调至所需pH值。0.50 mg/mL Fe(Ⅲ)溶液。所有试剂均为分析纯；实验用水均为超纯(UP)水.

1.2 实验方法

于10 mL比色管中，分别加入0.80 mL Fe(Ⅲ)溶液，0.30 mL 5-磺基水杨酸溶液，一定量的肝素钠工作液及1.0 mL pH=4.5 B-R缓冲溶液，用超纯水稀释至5 mL，混匀，反应20 min。用1 cm石英比色皿，在荧光分光光度计上同步扫描激发波长和发射波长，获得体系的共振散射光谱；于最大散射峰波长342 nm处测定试样溶液的共振散射强度Is和试剂空白的共振散射强度I0，并计算I=I0-Is。

2 结果与讨论

2.1 共振散射光谱

在pH=4.5 B-R缓冲介质中，Fe(Ⅲ)与5-磺基水杨酸反应生成紫红色配合物，其在257 nm和342 nm产生2个共振散射峰。加入肝素钠后，由于其在静电引力作用下与Fe(Ⅲ)-磺基水杨酸配合物形成离子缔合物，从而使得体系在257 nm和342 nm处的共振散射信号明显降低。实验表明，随着肝素钠浓度的增加，体系的共振散射信号随之降低(图1)。且体系在342 nm处的共振散射信号与肝素钠浓度之间有着良好的线性关系，故本文以342 nm为最佳测定波长。

2.2 反应介质的选取及酸度的影响

考察了反应介质HCl、H2SO4、H3PO4、NaAc-HAc、Walpole和B-R缓冲溶液对体系灵敏度和稳定性的影响。结果表明，B-R缓冲溶液较其它介质好，故本文选用反应介质为B-R缓冲溶液。对B-R缓冲溶液的不同pH值进行了实验，随着pH值增大，体系的△I值亦随之增大。当pH值为4.5时，△I最大，之后又随着pH值增大而减小。故本文选择B-R缓冲溶液的最佳pH值为 4.5。对pH=4.5 B-R缓冲溶液的不同用量进行了实验，结果表明，当其用量为1.0 mL时，体系的△I最大。

2.3 试剂加入顺序的影响

对Fe(Ⅲ)、5-磺基水杨酸、 肝素钠、B-R缓冲溶液的四种不同加入顺序进行了实验。结果表明，当以Fe(Ⅲ)+5-磺基水杨酸+肝素钠+B-R缓冲液顺序加入时，体系的信号强度及线性关系均较好。

2.4 Fe(Ⅲ)用量的优化

试验了Fe(Ⅲ)用量对体系灵敏度和稳定性的影响。结果表明，Fe(Ⅲ)与5-磺基水杨酸之间发生配位反应，其用量不足时，由于二者配位不完全使得体系的△I随之增大而增大；当其过量时，由于其与二者形成的配合物之间发生作用而使体系的△I又随之减小。当Fe(Ⅲ)的用量为0.8 mL时，体系△I最大且稳定。故本实验选用Fe(Ⅲ)用量为0.8 mL。

2.5 5-磺基水杨酸用量的优化

当5-磺基水杨酸用量少时，其与Fe(Ⅲ)配位反应不完全；若其用量过多时，会影响肝素钠与Fe(Ⅲ)-磺基水杨酸配合物的结合。按照实验方法，考察了5-磺基水杨酸的用量对体系的△I的影响，结果表明，当5-磺基水杨酸用量为0.3 mL时，体系的△I最大。故选用5-磺基水杨酸的最佳用量为0.3 mL。

2.6 反应时间的影响

在优化条件下，按照实验方法考察反应时间的影响，结果表明试剂混合后即开始反应，反应20 min后，体系的共振散射信号基本不变。说明此体系的最佳反应时间为20 min。

2.7 工作曲线与检出限

按照实验方法，以△I对肝素钠浓度作图，绘制了工作曲线。在0.05～15.0 μg/mL范围内，体系的△I与肝素钠浓度之间有较好的线性关系。其线性回归方程为：△I=77.24c+3.458，线性相关系数为0.9976，检出限为39.9 ng/mL。

2.8 共存物质的影响

2.9 样品分析

分别准确移取3种不同批号的肝素钠注射液(标示效价12 500 IU/2mL)1.0 mL于100 mL容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，摇匀。再分别准确移取各稀释液1.0 mL，按照实验方法进行测定，并做加标回收实验，结果见表1。样品的回收率在98.9%～102.2%之间,表明该方法有较好的重现性和可靠性。

表1 样品分析结果

3 结论

本文探讨了在B-R缓冲介质中，Fe(Ⅲ)与5-磺基水杨酸配位生成紫红色配合物，继而其在静电引力作用下与肝素钠结合形成离子缔合物而使体系共振散射信号减弱的各种反应条件。研究发现，体系的共振散射信号与肝素钠的浓度之间存在较好的线性关系，从而建立了测定肝素钠注射液中肝素钠含量的新方法。