L-半胱氨酸/纳米金/DNA/壳聚糖修饰金电极测定布洛芬

李 玲，王 娟，刘计敏，张 燕，郑 晶，郭满栋

(山西师范大学化学与材料科学学院,山西临汾 041004)

布洛芬(Ibuprofen)化学名为2-甲基-4-(2-甲基丙基)苯乙酸，它是一种非甾酮类药物，具有抗炎、镇痛及解热作用，可用于治疗牙疼、小儿发热头疼等症状，其对小儿退热效果比同类药物更好更快更安全，常用于儿童退热首选药[1]。因此，对布洛芬的准确测定对于相关药物的质量控制起着十分重要的作用[2]。常用于测定布洛芬的分析方法有高效液相色谱法[3]、液-质联用法[4]、气-质联用法[5]、紫外-可见分光光度法[6]、电化学方法[7]。其中，电化学方法具有操作简便，成本低、灵敏度高、重现性好、具有良好的选择性等优点被广泛应用[8,9]。

贵金属纳米材料如纳米金、纳米银、纳米铂等纳米粒子具有一些共同的性质，如高的比表面积、强的吸附能力、良好的导电能力以及特殊的光学性质，作为修饰材料广泛应用于化学修饰电极,并常用作催化剂[10]。特别是Au纳米材料在生物领域不但可以固定蛋白质还能保证其电化学活性[11]，这一优良特性广泛应用于电化学生物传感器[12]和电化学分析[13]。DNA是生命物遗传的基本物质，其具有大量的磷酸骨架，可以增加纳米金结合位点而被引入到电化学检测领域。核酸功能化的金纳米颗粒也逐渐成为了一种新颖的电化学信号放大装置，此类修饰电极具有快速、高效、灵敏、无污染、操作简便等优点。例如DNA电化学生物传感器可用于测定各类能与DNA相作用的药物如：抗生素、抗病毒、抗肿瘤抗癌等药物[14,15]。

本文采用了电聚合方法和简便快捷的滴涂法，先将L-半胱氨酸电聚合在裸金电极表面，再将纳米金、DNA、壳聚糖混合液滴涂在L-半胱氨酸聚合后的金电极表面上，制备了一种新型的L-半胱氨酸/纳米金/DNA/壳聚糖(L-Cys/Au colloid/DNA/CS/Au/CME)化学修饰电极，此修饰电极具有成本低，制备简单，灵敏度高，稳定性和重现性好等特点。实现了对布洛芬快速、准确的测定，并研究了布洛芬在该修饰电极上的电化学行为。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LK2005A型电化学工作站(天津市兰力科化学电子高技术有限公司)，电化学实验采用三电极体系：Ag/AgCl(饱和KCl)电极为参比电极；铂丝电极为辅助电极；裸金电极(d=2 mm)和修饰金电极为工作电极。雷磁PXSJ-216型离子计(上海精密科学仪器有限公司)；微型进样器(上海医学激光仪器厂)；电子天平(北京赛多利新型仪器系统有限公司)；JB-2定时双向磁力加热搅拌器(江苏金坛市金城国胜实验仪器厂)；KQ-250B超声波清洗器(昆山市超声波仪器制造厂)。

K3[Fe(CN)6](天津市光复科技发展有限公司)，配制浓度为2.5×10-3mol/L。FeCl3(天津市科密欧化学试剂有限公司)，配制浓度为2.5×10-3mol/L。K4[Fe(CN)6](天津市光复精细化工研究所)，配制浓度为2.5×10-3mol/L 。HAuCl4·4H2O、DNA、L-半胱氨酸均购自国药集团化学试剂有限公司，储备液均为1.5×10-3mol/L，布洛芬(IB，博美生物技术有限公司)，储备液浓度为1.0×10-3mol/L。其余实验所用试剂均为分析纯；实验用水为二次蒸馏水；所有电分析实验均在室温下进行。

1.2 L-Cys/Au colloid/DNA/CS/Au/CME的制备过程

1.2.1裸金电极的预处理将裸金电极(d=2 mm)用鹿茸皮打磨抛光，依次用水、HNO3(1+1)、无水乙醇、水各超声5 min。然后将电极置于0.5 mol/L的H2SO4中用循环伏安法(电位区间：-0.2～1.6 V，扫速：0.1 V/s)扫描10圈进行活化。然后用水冲洗干净，高纯氮气吹干备用。

1.2.2Aucolloid的制备纳米金溶胶的制备[16]:准确称取0.0160 g HAuCl4·4H2O于50 mL的烧杯溶解，用加热搅拌器快速搅拌并将溶液加热至沸腾，接着迅速向其中滴加6滴1%的柠檬酸钠溶液，2 min后再连续滴加至2.0 mL，继续加热搅拌。当溶液沸腾5 min以后，关掉加热档，余温加热，继续搅拌20 min后，放在室温下冷却后出现酒红色溶液，即为纳米金胶体，置于冰箱4 ℃避光保存。

1.2.3壳聚糖(CS)储备液的制备将4 mg CS溶于0.2 mL冰乙酸，稀释至1 mL，超声至完全溶解，置于冰箱4 ℃保存备用。

1.2.4L-Cys/Aucolloid/DNA/CS/Au/CME的制备将经预处理后的裸金电极浸入到盛有10 mL L-Cys溶液(1.0×10-3mol/L)的电解池中，进行循环伏安法扫描(电位区间：-0.2～1.6 V，扫速：0.01 V/s，扫描次数：10次)，使L-Cys沉积在裸金电极表面，在室温下避光、晾干24 h后使用。于新配制的CS溶液中加入200.0 μL新制备的纳米金溶胶，之后加入300.0 μL 0.0004 g/mL的DNA储备液，继续超声至三者混合均匀。用微型进样器将5.0 μL混合液滴涂在L-Cys修饰的金电极上，在室温下避光、晾干24 h后使用。

1.3 实验方法

实验采用三电极系统，室温下以Ag/AgCl(饱和KCl)电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，修饰电极和裸金电极为工作电极。以pH=7.35的磷酸盐缓冲溶液(PBS)为底液，对布洛芬进行循环伏安和差分脉冲伏安测定。

2 结果与讨论

2.1 L-Cys/Au colloid/DNA/CS/Au/CME的电化学表征

用循环伏安法在扫速为0.1 V/s的条件下，以[Fe(CN)6]3-/4-作为分子探针对修饰过程中电极表面的变化进行表征。图1是裸金电极与各种修饰电极在含2.5×10-3mol/L [Fe(CN)6]3-/4-液溶中的循环伏安图。裸金电极在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中出现一对较弱的氧化还原峰(曲线a)。当在裸金电极表面电聚合一层L-Cys薄膜后(曲线c)，氧化峰电流和还原峰电流均明显增大，峰间距缩小。当在L-Cys修饰电极表面滴涂CS薄膜后(曲线b)，由于CS薄膜较厚并且导电能力差使得氧化峰电流和还原峰电流均有所降低，将Au colloid、CS混合物滴涂于L-Cys修饰电极表面后(曲线d)，纳米金粒子增大了电极的比表面积，促进了电子在电极表面的传递速度,氧化峰电流和还原峰电流均明显增大。将DNA、Au colloid、CS混合物滴涂于L-Cys修饰的电极表面后(曲线e)，由于DNA的磷酸骨架增加了纳米金的结合位点，加快了电子的传递速度，使得氧化峰电流和还原峰电流均明显增大，峰间距缩小。

2.2 布洛芬的循环伏安研究

图2中a、b分别为裸金电极和L-Cys/Au colloid/DNA/CS/Au/CME在PBS中的循环伏安图，由图可知L-Cys/Au colloid/DNA/CS/Au/CME在PBS(b)中进行循环伏安扫描时，在0.3879 V处出现一个灵敏的还原峰ip=56.4493 μA，在0.9980 V处有一个不太灵敏的氧化峰ip=-14.0964 μA，当把修饰电极置于含1.0×10-6mol/L布洛芬的pH=7.35的PBS(c)中进行循环伏安扫描时，在0.4560 V处出现还原峰，峰电流明显下降(ip=34.7889 μA)，峰位置发生偏移，在1.1320 V处出现不太灵敏的氧化峰(ip=-13.1025 μA)。可知布洛芬在L-Cys/Au colloid/DNA/CS/Au/CME上的反应为不可逆反应。在加入布洛芬后还原峰和氧化峰电流均降低，峰形未发生变化，说明布洛芬的加入抑制了电极的活性，使得电极表面传导电子的能力降低，从而峰电流降低。

2.3 L-Cys/Au colloid/DNA/CS/Au/CME测定条件的优化

2.3.1缓冲溶液的选择实验分别在PBS(pH=6.3)、HAc-NaAc(pH=3.98)、KH2PO4-硼砂(pH=7.35)、硼砂-NaOH(pH=11.2)、柠檬酸-柠檬酸钠(pH=7.5)等缓冲溶液中，用循环伏安法考察布洛芬在L-Cys/Au colloid/DNA/CS/Au/CME上的电化学行为。结果表明，选用PBS，背景电流显著减小，电子转移速度加快，峰形尖锐且峰电流高。

2.3.2pH的选择配制一系列不同pH 值(5.43、6.73、7.35、7.89、8.15)的PBS，分别测定布洛芬(1.0×10-6mol/L)在L-Cys/Au colloid/DNA/CS/Au/CME上的循环伏安曲线(图3)，B、C曲线分别为pH对还原峰和氧化峰的影响。当pH≤7.35时，还原峰和氧化峰电流随着pH值增加而增加；当pH>7.35时，随着pH的增加还原峰和氧化峰电流反而减小。在pH=7.35的PBS中峰电流最大且峰形最好。因此实验选择pH=7.35的PBS 缓冲溶液作为底液。

图4为还原峰电位E与pH值的关系图，图中还原峰电位E与pH值呈线性关系，且随着pH的增大还原峰电位负移，表明该电极反应有质子参与。其线性回归方程为：E(V)=-0.08112pH+1.0017(相关系数R2=0.9920)。根据线性回归方程可知，斜率为-0.08112，将其代入公式dEp/dpH=0.0592x/n(x为质子数，n为电子数)中，可求得x(P1)=1.3，即转移的质子数为1个。

2.3.3扫描速率的影响在选定的实验条件下，改变扫描速率(50、100、150、200、250 mV/s)，结果表明随着扫描速率的增加，还原峰电流IP也逐渐增加，还原峰电位EP发生负移。在扫速50～250 mV/s范围内，还原峰电流IP与扫速v成正比，扫速和峰电流呈线性关系，其线性回归方程为：IP=310.3v(V/s)+30.95(相关系数R2=0.9861)，说明布洛芬在L-Cys/Au colloid/DNA/CS/Au/CME上是受表面吸附控制的反应过程。

在50～250 mV/s范围内，还原峰电位EP随着扫描速率对数值的增加而增加，且二者呈良好的线性关系，EP-logv的线性方程为：EP(V)=-0.5115logv+0.3388(相关系数R2=0.9810)。根据线性方程可知，直线斜率为-0.5115，截距为0.3388。由其直线斜率为[0.5×2.303RT×(anF)-1],可得an=0.59,由于0

2.4 L-Cys/Au colloid/DNA/CS/Au/CME的响应性能

2.4.1线性范围和检出限配制了一系列不同浓度的布洛芬标准溶液，在0.6～1.4 V范围内，扫速为100 mV/s条件下在PBS中采用差分脉冲伏安法对其电化学响应进行测定。如图5所示，随着布洛芬浓度的不断增大，电子转移越困难，氧化峰电流下降记作I。将制备的L-Cys/Au colloid/DNA/Au/CME置于PBS中氧化峰电流为I0,△I=I0-I,实验表明布洛芬的峰电流变化值△I与其浓度在1.0×10-7～1.0×10-4mol/L范围内呈良好的线性关系，线性回归方程如下：I=-51.56logc+5.594(R2=0.9732)，检出限(S/N=3)可达2.3×10-8mol/L，说明该方法灵敏度较高。

2.4.2共存离子的干扰在最佳实验条件下，用L-Cys/Au colloid/DNA/CS/Au/CME测定1.0×10-6mol/L的布洛芬，100倍的尿嘧啶、尿酸、β-环糊精、抗坏血酸、葡萄糖、鸟嘌呤、L-半胱氨酸，50倍的葡萄糖、巴比妥、肾上腺素、多巴胺时,30倍的Fe3 +、Ca2 +、Al3 +、Cu2 +、Mg2 +、Zn2 +、Mn2 +对布洛芬的电化学响应干扰很小，此时布洛芬的最大峰电流变化值平均为1.9%，结果表明这些物质不干扰布洛芬的测定。

2.4.3重现性和稳定性新制备7根L-Cys/Au colloid/DNA/CS/Au/CME，在最佳实验条件下，分别对同浓度的布洛芬测定3次，相对标准偏差(RSD)为3.31%，室温保存一星期后，用同一根电极对布洛芬进行测定，电流响应基本保持不变，说明该修饰电极很稳定并且重现性良好。

2.5 样品分析

取布洛芬(合肥博美生物科技有限责任公司，标准量：25 克/瓶，纯度≥99%)，用水配制浓度为1.0×10-5mol/L溶液。然后用其与缓冲溶液配制一系列的标准溶液，测其峰电流，制成标准曲线。最后在中间的标准溶液中分别加入不同体积的布洛芬溶液，测其峰电流，利用工作曲线法得其浓度，求得样品的回收率。结果见表1。

表1 样品测定及回收率

3 结论

本文采用电聚合和滴涂的方法制得了L-Cys/Au colloid/DNA/CS/Au/CME，并用循环伏安法表征各种修饰电极在修饰过程中的变化。研究了布洛芬在该修饰电极上的电化学行为，结果表明在最佳实验条件下，该修饰电极对布洛芬有明显的响应，检出限(S/N=3)达2.3×10-8mol/L。方法用于实际样品中布洛芬的测定，其回收率范围在96.73%～103.54%。