固相萃取-液相色谱-串联质谱法同时检测海水中抗生素多残留

孙晓杰，李兆新*，董 晓,3，邢丽红， 周德山，宋新成

(1.农业部水产品质量安全检测与评价重点实验室中国水产科学研究院 黄海水产研究所，山东青岛 266071;2.国家水产品质量监督检验中心,山东青岛 266071;3.上海海洋大学食品学院,上海 201306；4.江苏省连云港市海洋环境监测预报中心，江苏连云港 222001)

随着畜禽和水产养殖规模的不断扩大，动物疾病频发，用来预防和治疗疾病的抗生素种类和用量也在日益增加。水环境中抗生素主要来源于抗生素工业废水、医用抗生素(医院和家庭使用的抗生素)和兽用抗生素等[1]。水环境中抗生素污染不仅影响水产养殖业的健康发展，还进一步威胁着生态环境安全[2 - 4]。由于目前医药生产和养殖使用的抗生素种类繁多，导致水环境中抗生素污染成分复杂。同时其在大量水体中多以痕量或超痕量存在,加之浮游生物及微小颗粒等对测定存在不同的干扰,因此水环境中抗生素的提取分析技术是影响其污染效应研究的关键因素。目前用于检测抗生素残留的分析方法有高效液相色谱法[5 - 7]、气相色谱法[8]、酶标法[9,10]、色-质联用法[11,12]等,研究报道主要集中于食品基质的检验技术领域,用于海水等环境水样中抗生素的检测方法关注较少,且痕量检测用常规色谱法无法达到要求，检测种类也仅限于一种或几种[13 - 16]。因此，急需建立水中多类多种抗生素残留的快速检测方法。固相萃取技术(SPE)结合液相色谱-串联四级杆质谱技术(HPLC-MS/MS)可以对目标物准确定性定量，是目前水环境中抗生素多残留检测的主要技术。

本研究选择养殖过程中常用的8种磺胺类、3种喹诺酮类、3种氯霉素类和4种四环素类抗生素作为研究对象,采用SPE技术对目标物进行富集浓缩,HPLC-MS/MS联用技术检测,建立了水样中痕量抗生素多残留的高灵敏检测方法,从而实现了水环境中抗生素污染水平的快速筛查。本方法与相同仪器条件测试的其他报道相比[13,14]，灵敏度得到不同程度提高。并将所建立的方法应用于实际海域环境水样中抗生素多残留的调查。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

TSQ QuantumAccessTM 液相色谱-串联质谱仪(美国，Thermo Fisher Scientific公司)；Talboys型旋涡混合器(上海安谱科学仪器有限公司)；BT224S分析天平(法国，Sartorius公司)；N-EVAPTM112型氮气吹扫仪(美国，Organomation公司)；Milli-Q 型超纯水仪(美国，Millipore公司)。固相萃取装置(美国，Supelco公司)；AUQA LOADER 698全自动上样装置(日本，岛津公司)；C18小柱(200 mg/3mL，美国，Waters公司)，PPL小柱(200 mg/3mL，美国，安捷伦公司)，PLS-3小柱(200 mg/6mL，日本，岛津公司)。

氯霉素(纯度98.5%)、甲砜霉素(纯度98.5%)、氟甲砜霉素(又名氟苯尼考，纯度99.5%)、磺胺嘧啶(纯度99.0%)、磺胺甲基嘧啶(纯度99.2%)、磺胺二甲基嘧啶(纯度99.0%)、磺胺甲噁唑(纯度99.5%)、磺胺二甲异噁唑(纯度98.7%)、磺胺噻唑(纯度99.5%)、磺胺多辛(纯度99.0%)、磺胺喹噁啉(纯度97.5%)、诺氟沙星(纯度99.5%)、环丙沙星(纯度95.0%)、恩诺沙星(纯度98.5%)、土霉素(纯度97.5%)、金霉素(纯度99.0%)、四环素(纯度98.0%)、强力霉素(纯度98.7%)，所有标准品均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。乙腈、甲醇为色谱纯(Merk公司)；甲酸为色谱纯(Fluka公司)。标准储备液：分别称取适量标准品，用甲醇溶解并定容，配制成1.0 mg/mL的标准储备液，于-18 ℃ 保存。混合标准溶液：分别取适量各标准储备液，用流动相稀释成所需浓度的混合标准工作使用液，现用现配。

海水样品采自青岛黄海近岸海域。

1.2 样品处理

海水样品取自水面下0.5 m处。首先用0.45 μm水系滤膜除去悬浮颗粒，再用稀HCl调节水样pH至4.0左右，然后取500 mL水样以5 mL/min流速通过PLS-3固相萃取小柱进行富集和净化。小柱上样之前依次用3 mL甲醇和3 mL水活化。水样过完柱后，用3 mL水淋洗，减压抽干后用6 mL甲醇分2次洗脱，洗脱液在40 ℃下用氮气吹干，用1 mL初始流动相定容，充分涡旋溶解残渣,滤液经0.22 μm 微孔滤膜过滤，待上机分析。

1.3 色谱-质谱条件

色谱条件：Waters C18色谱柱(150×2.1 mm，3 μm)；流动相：A为0.1%甲酸水溶液；B为0.1%甲酸乙腈溶液。梯度洗脱程序：0.0～0.5 min，10%B；0.5～3.0 min，10%～70%B；3.0～5.0 min，70%～90%B；5.0～8.0 min，90%B；8.0～9.0 min，90%～10%B；9.0～10.0 min，10%B；流速0.2 mL/min；进样量:10 μL；柱温：35 ℃。

质谱条件：电喷雾电离源(ESI)，多反应监测(MRM)离子模式；氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素选择负离子检测，喷雾电压为4.2 kV，其他抗生素类选择正离子检测，喷雾电压为3.5 kV；鞘气和辅助气体均为高纯氮气，鞘气流速：10 L/min，辅助气流速：5 L/min，碰撞气为氦气，诱导解离电压为10 V；离子传输杆温度为350 ℃。碰撞能及抗生素的其他相关质谱条件见表1。

表1 18种抗生素的相关质谱参数

(续表1)

* quantitative ion.

2 结果与讨论

2.1 固相萃取条件的优化

2.1.1固相萃取小柱的选择18种目标抗生素皆为极性化合物，多采用SPE柱富集，去除基质中杂质干扰，并获得较高的回收率。本研究考察了C18、PPL和PLS -3三种不同SPE小柱对目标物的萃取效果(图1)，每个小柱在优化条件下各做3个平行。研究结果表明，采用PLS -3 SPE柱时18种物质的响应都较高，且对各组分的回收率较为理想，均达到70.0%以上，重现性好，因此本实验最终选择PLS -3 SPE柱。

2.1.2上样pH值优化以500 mL空白海水为基底，分别调整pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，然后加入目标抗生素混合标准溶液,混匀后参照1.2方法进行上样处理，结果见图2。结果表明pH值对氯霉素类的回收率影响较小，但对于磺胺类、沙星类和四环素类，当pH为4.0时，目标抗生素的回收率普遍较高，重现性较好。因此，本研究选择上样溶液的pH为4.0。

2.1.3洗脱溶剂及洗脱量优化本实验分别考察了甲醇、乙腈和80%甲醇水对目标抗生素类的洗脱效果，结果表明甲醇对各种抗生素的洗脱能力最强。同时分别优化4.0、6.0、8.0、10.0 mL几种不同洗脱量对回收率的影响，发现当分两次洗脱，总洗脱量是6.0 mL时对目标物的回收率已经达到70%以上，当洗脱量超过6.0 mL后，回收率没有明显增加。因此本实验选择6.0 mL甲醇分两次洗脱。

2.2 检出限、回收率和精密度

在优化实验条件下，用初始流动相配制系列浓度的标准溶液。以每种目标物定量离子的峰面积与质量浓度作标准曲线。从表2可以看出，18种抗生素在对应范围内线性关系良好，相关系数均大于0.990。本文采用向空白海水中添加标准溶液的方法，取样500 mL，得到方法对18种抗生素的检出限(LOD，按S/N=3计算)为1.0～10.0 ng/L，回收率在70.0%～120%之间，相对标准偏差皆小于10%，说明方法的准确性和灵敏度较高，重现性好，适合于水样中抗生素多残留的同时检测。

表2 海水中添加抗生素的回收率实验(n=6)

2.3 样品测定

分析了采自青岛黄海近岸不同海域的5份海水样品。结果表明，5个样品中都未检测到18种抗生素残留，可能原因主要有：自然海域面积较大,对抗生素等污染有更好的稀释作用；同时海水流动交换能力强，有一定的自清洁能力；另外，抗生素进入水体后，大部分被底泥等沉积物吸附，会降低其在海水中的浓度。通过实际样品测定表明，本研究方法对于海水基质净化效果较好，可拓展适用于其他水样中抗生素多残留的测定。

3 结论

本方法利用固相萃取技术同时富集海水中的18种抗生素药物,并建立了液相色谱串联质谱联用仪器检测方法。结果表明方法具有较高的灵敏度，检出限在1.0～10.0 ng/L之间；同时选用三个不同浓度的加标实验，回收率为71.6%～117%，方法的重现性较好，可以满足当前对环境水样中抗生素多残留快速筛查的要求。方法成功应用于黄海近岸海域海水中抗生素多残留的分析，并将拓展应用于养殖海域和污染水源抗生素多残留的快速筛查。