酵母菌β-D-葡萄糖苷酶酶学性质及对葡萄酒香气的影响研究进展

周立华，牟德华，李　艳，2

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050018； 2.河北省发酵工程技术研究中心，河北石家庄050018）

酵母菌β-D-葡萄糖苷酶酶学性质及对葡萄酒香气的影响研究进展

周立华1，牟德华1，李艳1，2

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050018； 2.河北省发酵工程技术研究中心，河北石家庄050018）

阐述了产β-D-葡萄糖苷酶酵母菌的筛选及分子鉴定，酵母菌β-D-葡萄糖苷酶的理化性质、分离提纯和固定化。重点对酵母菌β-D-葡萄糖苷酶在增强葡萄酒香气方面的应用进行了论述和展望。

酵母； β-D-葡萄糖苷酶； 葡萄酒； 香气

葡萄中的单萜烯类物质是葡萄酒香气的重要成分，而它们大多数以与糖苷结合态的形式存在，经过发酵进入葡萄酒中［1］。香气糖苷是葡萄酒活性香气成分的预备库，比它们对应的游离态配基多几倍，甚至几十倍［2］。目前，在葡萄酒行业中主要应用β-D-葡萄糖苷酶水解葡萄中与糖苷结合的单萜类物质，从而释放糖苷及单萜增加葡萄酒的香气［3］。

β-D-葡萄糖苷酶广泛存在于植物、细菌、霉菌和酵母菌中［4］，可以水解含有β-D-葡萄糖苷键的物质，使之产生葡萄糖及相应的配基［5］。19世纪初，发现此酶的作用后［6］，被广泛应用到食品行业，尤其是葡萄酒增香方面，对提高葡萄酒的品质具有很好的促进作用。

目前，葡萄酒行业多使用黑曲霉产生的β-D-葡萄糖苷酶制剂，虽然提高了葡萄酒的香气，但同时也增加了葡萄酒中外来蛋白质的含量，造成葡萄酒稳定性的潜在威胁［7］。因此，筛选产β-D-葡萄糖苷酶的酿酒酵母，利用其进行葡萄汁酒精发酵的同时可水解葡萄中的萜烯类物质释放香气物质。对近年来产β-D-葡萄糖苷酶酵母菌的筛选和鉴定，以及酵母产β-D-葡萄糖苷酶的酶学性质和在葡萄酒增香方面研究成果的总结论述的目的是促进对产酶酵母菌及其酶制剂的应用，提高葡萄酒的感官品质和香气特性。

1　产β-D-葡萄糖苷酶酵母菌的筛选

筛选高产β-D-葡萄糖苷酶的酵母菌，并应用于葡萄酒的酿造过程具有深远意义。主要方法是采用平板固态选择培养基进行酵母菌培养，初步筛选得到产酶单菌落，再经过液体发酵实验得到酶液，测定酶活力得到高产菌株。

选择培养基时，依据成分可分为pNPG显色法［8-9］、栀子苷元显色法［10-11］、七叶苷显色法［12-14］、α-纤维素显色法［15-17］、纤维素-刚果红［18-20］、刚果红CMC-Na显色法［21］、4-MUG法［22-26］和熊果苷法［27］等，原理见表1。

表1　产β-D-葡萄糖苷酶酵母菌的筛选方法与原理

对产酶菌株的筛选方法，依不同环境，不同筛选目的，所用的筛选方法不同，比如在实验室中进行小批量筛选时，运用pNPG法较实用，如果大批量筛选，运用七叶苷显色法较为适用。

2　测定β-D-葡萄糖苷酶活性的方法

检测β-D-葡萄糖苷酶活力的方法可分为比色法、分光光度法、荧光法等，底物不同可分为pNPG法、MUG法、水杨苷法、京尼平苷法等。

对硝基苯基β-D-葡萄糖苷，简称pNPG，是一种人工合成的酶底物，与β-D-葡萄糖苷酶有很强的反应能力，是目前国内测定β-D-葡萄糖苷酶活性最常用的底物，主要原理为pNPG被β-D-葡萄糖苷酶水解生成的对硝基苯酚在经过碳酸钠终止反应后呈现黄色，在400～420 nm具有吸收峰，可通过比色最终对酶活进行测定。如Wanapu C等［21］筛选产β-D-葡萄糖苷酶的酵母菌运用pNPG法测定酶活性，在900 μL反应体系中，加入3.3 mM 的pNPG，100 mM缓冲溶液（pH5），100 μL粗酶液在50℃反应25 min，反应结束后加入2 mL 1 M的Na2CO3终止反应，在400 nm检测吸光度；Ünal M Ü等［29］也以pNPG为底物对1株从玫瑰香葡萄中分离筛选的产β-D-葡萄糖苷酶酵母进行了酶活的测定；Y Gueguen等［30］以Duolite A-568交换树脂为固定化载体对β-D-葡萄糖苷酶进行了固定化，然后以pNPG为底物对固定化后的酶进行酶活的测定，又研究了固定化β-D-葡萄糖苷酶对葡萄酒香气的影响；Barbagallo R N等［27］对霉菌和酵母菌所产β-D-葡萄糖苷酶的活性进行了测定，并比较了两者所产酶理化特性和对葡萄酒的增香实验，得到很好的结果。

除pNPG法外，京尼平苷法、水杨苷法也有广泛的应用，梁华正等［31］建立了以京尼平苷为底物检测β-D-葡萄糖苷酶活力的方法，利用京尼平苷经β-D-葡萄糖苷酶水解后释放京尼平，京尼平与氨基酸反应生成稳定的蓝色化合物，在590 nm具有特征吸收峰，经实验证明，京尼平苷法的精密度与准确性较好，结果较稳定；以水杨苷为底物的方法测定的是经过β-D-葡萄糖苷酶水解产生极微量的葡萄糖，虽然实验检测的量很少，可以满足一些β-D-葡萄糖苷酶少量反应的实验，但反应易受到干扰，且检测灵敏度不好［32］。

3　β-D-葡萄糖苷酶的理化性质

3.1β-D-葡萄糖苷酶的活性中心结构

研究表明，绝大多数β-D-葡萄糖苷酶起催化作用的是具有活性的2个催化残基，这2个残基分别为起到酸碱作用的靠近N-端的谷氨酸和另一端具有亲核试剂作用的氨基酸［33］。此外，也有少数研究发现并不是只有2个氨基酸残基具有催化作用，如Grabnitz等［34］研究发现来自Clostridium thermocellum的β-D-葡萄糖苷酶的活性部分在N端有130个氨基酸区域，该区的个性特征是氨基酸序列中心基团His-Asn-Glu-Pro，存在于该区域的具有催化作用的残基是相隔35～55个氨基酸的His和Glu，其中质子化态的完全保持残基His121作为质子供体与Glu166协同稳定氧碳正离子。而高度保守的C端附近的残基有可能参与了酶与糖苷基底物的键合，其中在该区的一些微小差异与不同β-D-葡萄糖苷酶的底物特异性有关。

3.2影响β-D-葡萄糖苷酶活力的因素

影响β-D-葡萄糖苷酶活性的因素有很多，如反应时的温度、反应体系pH值、反应时间和底物浓度等，其中最主要的影响因素是温度与pH值。不同来源的β-D-葡萄糖苷酶其最适反应条件不同。

β-D-葡萄糖苷酶的最适反应温度及热稳定性温度范围较大，最低40℃，最高可达110℃，一般微生物所产β-D-葡萄糖苷酶最适温度都在50℃左右，而有些古细菌的最适反应温度可达100℃以上。绝大多数β-D-葡萄糖苷酶的最适pH值在酸性范围，一般在3.5～5.5之间，也可以在7.0左右，对pH值的要求较高。如Wanapu C等［21］筛选出了1株高产β-D-葡萄糖苷酶的酵母菌，并研究了其最适反应条件，结果表明，筛选菌的最适pH值为5.0，最适温度为50℃，在20℃、30℃和40℃温度下的酶活力可以保持在80%以上，能极大地满足在酿酒期间的温度要求，为该菌株在酿造葡萄酒中的应用提供了依据。Hernandez L F等［9］研究了1株产β-D-葡萄糖苷酶的酿酒酵母，在实验中发现该菌株所产的β-D-葡萄糖苷酶最适pH4.0，最适反应温度40～50℃，很接近酿造葡萄酒过程中的低pH值环境，为利用该野生酿酒酵母提供依据。

除温度与pH值外，酒精度和金属离子等因素也对β-D-葡萄糖苷酶的活性产生影响，尤其是金属离子，其种类对酶活性的影响可分为促进与抑制两种作用。

4　β-D-葡萄糖苷酶的分离、纯化和固定化

4.1β-D-葡萄糖苷酶的分离与纯化

为了得到相对较纯的酶液，一般都要进行很复杂的分离过程，胞外酶的分离纯化过程一般为：发酵液离心去除菌体→上清液进行酶沉淀→离心得到沉淀→缓冲溶液溶解→透析去除盐离子→浓缩→固相柱分离→洗脱→去盐浓缩待用。

分离纯化的首要步骤是发酵液离心与酶沉淀，沉淀剂可选硫酸铵、乙酸铵和丙酮等，目前最常用的沉淀剂为饱和硫酸铵溶液，Wanapu C等［21］以80%的硫酸铵沉淀酿酒酵母的产酶发酵液，然后将沉淀溶于磷酸钠缓冲溶液（pH7），透析浓缩后通过负离子交换色谱柱，以0～0.5 mM的KCl进行梯度洗脱，收集流出液，再进行透析，最后经过羟基磷灰石分离柱，再经过20～500 mM的磷酸盐缓冲溶液进行梯度洗脱，得到高纯度的β-D-葡萄糖苷酶；González-Pombo P等［35］用70%的硫酸铵对酶液进行沉淀过夜，再进行溶解、去除盐离子等过程，最终得到高纯度的β-D-葡萄糖苷酶，经测定酶活可达0.14 EU/g；宋娜娜［36］、郑淑霞［37］、孟宪文［38］和石贤爱［39］等也利用硫酸铵对发酵液中的酶进行分级沉淀，再经过层析柱分离纯化，最终得到较纯的β-D-葡萄糖苷酶；Ünal M Ü等［29］和祝霞等［40］分别用丙酮对酵母菌产酶发酵液中β-D-葡萄糖苷酶进行了沉淀，再经过透析及凝胶柱层析等过程，最终得到浓缩的糖苷酶。

4.2β-D-葡萄糖苷酶的固定化

目前，对β-D-葡萄糖苷酶的研究大多数是游离态，然而由于酶的稳定性低及不能重复利用，使成本升高。相对于游离态的酶，固定化的β-D-葡萄糖苷酶具有贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用等优点［41］。β-D-葡萄糖苷酶固定化的方法可分为吸附法、共价结合法、交联法、包埋法或2种甚至多种方法的联合使用。固定化所用的载体可大致分为有机高分子载体、无机化合物载体以及新型载体等。

4.2.1吸附法

吸附法是利用非化学变化的物理吸附、离子键吸附等方法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式，吸附、纯化与固定化可以同时进行，并且具有载体在失活后可以进行再生的优点［42］。Gueguen Y等［43］以A-568离子交换树脂为吸附剂对假丝酵母所产的β-D-葡萄糖苷酶进行固定化，固定化后的酶用蒸馏水进行清洗，再利用pH4，1 M的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液进行清洗，利用固定化酶发酵玫瑰香葡萄酒，研究对酒香气的影响，经GC-MS检测结果显示：橙花醇、香叶醇、芳樟醇、松油烯等萜烯类物质含量明显增加，且固定化酶表现了很好的稳定性。Yannick G等［44］以DuoliteA-568为吸附剂固定β-D-葡萄糖苷酶，用固定化酶在流化床和固定床2种反应器中进行葡萄酒中风味前体物质水解实验，结果表明，流化床反应器可在375 min后把前体物质100%水解，优于在400 min后水解90%前体物质的固定床反应器，为葡萄酒香气的改善提供了依据。

4.2.2共价结合法

共价结合法是用固相支持物表面上的反应基团与酶蛋白分子表面的功能团之间发生反应，形成化学共价键连接来对目标酶进行固定的方法。该方法由于结合键之间的连接较为牢固，所以稳定性较好，在β-D-葡萄糖苷酶的固定中较为常见。其载体一般为天然高分子（琼脂糖、纤维素、淀粉等）、高聚物和一些无机支持物等。González-Pombo P等［1］以Eupergit C为载体与β-D-葡糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶和α-鼠李糖苷酶3种糖苷酶进行共价结合，在固定化过程中考虑了反应体系的pH值、反应时间与缓冲盐浓度等变量的影响，最终确定的反应条件为pH 7.0，反应时间4 d，缓冲盐浓度为1 M，得到的酶固定率高于60%，酶活维持最高80%以上，经过对葡萄酒香气的影响实验显示，游离态的单萜烯类物质由1119 μg/L升为2132 μg/L。

4.2.3交联法

交联法是利用交联剂和酶分子之间进行交联结合形成共价键，从而得到三向交联网状结构，达到对β-D-葡萄糖苷酶的固定化。G Matthijs等［44］以葡聚糖二醛为交联剂，通过2种方法对β-D-葡萄糖苷酶进行固定化，一种是将糖苷酶与葡聚糖二醛进行交联后包埋于氨基丙基硅胶中；另一种为β-D-葡萄糖苷酶包埋于经过葡聚糖二醛进行改性的硅胶中，2种方法比较的结果显示，第1种固定化方法β-D-葡萄糖苷酶的热稳定性远优于第2种直接包埋法。

4.2.4其他固定方法

除以上固定方法外，还有包埋法和几种固定方法联用法，联用法可以弥补某些单一方法的不足，增加固定化酶的稳定性等性能。王瑾等［45］以壳聚糖、海藻酸钠为包埋材料，戊二醛为交联剂，固定化β-D-葡萄糖苷酶，研究了固定化条件与酶活力回收的关系。通过单因素和正交实验确定了最佳固定化条件，即壳聚糖（脱乙酰度为85%）浓度1.5%、海藻酸钠浓度2%、戊二醛浓度1%，pH5，固定化酶活力回收率达到83.8%。固定化酶最适作用温度60℃，最适pH5，该固定化酶重复使用5次，其活力仍能保持70%。朱均均等［30］以壳聚糖微球为吸附剂载体，以戊二醛为交联剂，采用吸附-交联法固定化β-D-葡萄糖苷酶，通过正交优化得到最优的固定化条件为：pH5.0，酶用量48.6 IU/g的β-D-葡萄糖苷酶经壳聚糖微球吸附12h后，在25℃、1.0%戊二醛的存在下交联2 h，得到酶活力为41.76 IU/g和酶活回收率为85.93%的固定化酶，得到了预期的实验结果。

5　β-D-葡萄糖苷酶对葡萄酒香气的影响

5.1葡萄中香气前体物的化学组成

葡萄果实中具有呈香作用的物质主要有萜烯类化合物、甲氧基吡嗪、挥发性硫化物和C13-降异戊二烯衍生物等，这其中最主要的香气来源为萜烯类物质。虽然萜烯类物质决定着葡萄果实的香气特点，是葡萄酒中品种香的主要来源，但是大部分的萜烯类物质以结合态存在于葡萄中，是某些香气物质与糖类物质结合形成的化合物，结合态的香气物质是不具有挥发性的物质。香气前体物从结构上可以分为糖基和配基两部分，葡萄果实中的糖基主要有O-β-D-糖苷和O-双糖苷两大类，香气物质可以与β-D-吡喃葡萄糖连接，也可以在与β-D-吡喃葡萄糖连接的基础上与第二个单糖进行连接，这些单糖一般为α-L-呋喃阿拉伯糖、α-L-吡喃阿拉伯糖、β-D-吡喃葡萄糖、β-D-呋喃芹菜糖和β-D-吡喃木糖［46-47］，大多数葡萄果实中的糖苷是以二糖苷的形式存在。目前，在葡萄果实中已经鉴定出的糖基有4种，为：β-D-吡喃葡萄糖苷（β-D-glucopyranosides）、6-O-（α-L-吡喃鼠李糖基）-β-D-吡喃葡萄糖苷［6-O-（a-L-rhamnopyranosyl）-β-D-glucopyranosides］、6-O-（α-L-呋喃阿拉伯糖基）-β-D-吡喃葡萄糖苷［6-O-（a-L-arabinofuranosyl）-β-D-glucopyranosides］、6-O-（β-D-呋喃芹菜糖基）-β-D-吡喃葡萄糖苷［6-O-（β-D-apiofuranosyl）-β-D-glucopyranosides］［48］。很多麝香葡萄中键合态香气物质含量最多的成分为芹菜糖苷、芸香糖苷和葡萄糖苷，在某些品种的葡萄中芹菜糖苷可以超过50%，葡萄糖苷含量一般在4%～37%之间［49-50］。葡萄果实中的配基种类很多，主要有萜醇、C13-降异戊二烯类、醇类、酸类和莽草酸途径的代谢产物。萜烯基糖苷物质配基主要为萜醇及相应的氧化还原产物，也包括萜二醇、萜三醇和里那醇氧化物等环氧化物［51］。

5.2β-D-葡萄糖苷酶对葡萄酒香气的影响

β-D-葡萄糖苷酶的水解机理针对不同的糖苷键合态的香气物质，其作用机理有所不同，一般只有一种β-D-吡喃葡萄糖连接的香气前体物质，可以直接经过β-D-葡萄糖苷酶水解释放葡萄糖和相应的香气物质；对于连接2个单糖的香气前体物质，在水解过程中需要进行两步水解机制，第一步是在相应的双糖苷酶的作用下，水解去除β-D-芹菜糖、α-L-鼠李糖或α-L-阿拉伯糖形成单糖苷；第二步是在β-D-葡萄糖单糖苷酶的参与下，彻底水解糖苷而释放出相应的糖配体和配基［52］，进而对葡萄果实或葡萄酒起到增香的作用。经过β-D-葡萄糖苷酶水解释放的香气物质有芳樟醇、萜品醇、香叶醇、橙花醇等，这些物质在经过β-D-葡萄糖苷酶的水解后含量会明显增加，Wanapu C等［21］使用自筛酵母菌进行葡萄酒发酵实验，以普通酵母菌为对照组，结果发现葡萄酒中乙酸己酯、芳樟醇、苯乙醇、橙花醇、香叶醇等的含量明显增加，充分证明了β-D-葡萄糖苷酶对葡萄酒增香的作用；González-Pombo P［1］等将固定化的β-D-葡萄糖苷酶加入到玫瑰香白葡萄酒中，经过20 d的水解，结果显示，游离态的单萜烯类物质由原来的1119 μg/L增加到2132 μg/L，尤其香叶醇含量增加了其风味阈值的3～4倍；另外，Cordero Otero R R等［53］、Wang Y等［54］和Vernocchi P等［55］也就β-D-葡萄糖苷酶对葡萄酒中香气物质的影响进行了研究，得到了相同的结果。

6　展望

对酿酒酵母产β-D-葡萄糖苷酶的产酶机理和酿酒作用机理的研究目前仍处于初步阶段，对于酵母菌发酵酒精和产酶，以及酶水解释放香气彼此之间的关系还不十分清楚，对β-D-葡萄糖苷酶以及在葡萄酒增香方面的研究依然是一个具有深远前景的研究课题和方向，吸引着很多科研工作者为之努力。

［1］González-Pombo P，Fariña L，Carrau F，et al.Aroma enhancement in wines using co-immobilizedAspergillus niger glycosidases［J］.Food Chemistry，2014，143：185-191.

［2］陶永胜，牟含，李国，等.野生胶红酵母糖苷酶水解媚丽新酒中香气糖苷研究［J］.农业机械学报，2014（12）：37.

［3］GallifuocoA，Alfani F，Cantarella M，et al.Immobilized β-glucosidase for the winemaking industry:study of biocatalyst operational stability in laboratory-scale continuous reactors［J］.Process Biochemistry，1999，35（1）：179-185.

［4］Rodríguez M E，Lopes C，Valles S，et al.Selection and preliminary characterization of β-glycosidases producer Patagonian wild yeasts［J］.Enzyme and Microbial Technology，2007，41（6）：812-820.

［5］王玉霞，张超.一株野生酵母β-葡萄糖苷酶特性研究［J］.食品工业，2014（5）：52.

［6］Feldwisch J，VenteA，Zettl R，et al.Characterization of two membrane-associated beta-glucosidases from maize（Zea mays L.）coleoptiles［J］.Biochem J，1994，302：15-21.

［7］王彩肖，武伟伟，李艳.产β-D-葡萄糖苷酶酵母菌的筛选及产酶性质研究［J］.酿酒科技，2014（10）：14-22.

［8］侯晓瑞，王婧，杨学山，等.甘肃河西走廊葡萄酒产区高产β-葡萄糖苷酶酵母菌株筛选［J］.食品科学，2014，35（23）：139-143.

［9］Hernandez L F，Espinosa J C，Fernandez-Gonzalez M，et al. β-Glucosidase activity in a Saccharomyces cerevisiae wine strain［J］.International Journal of Food Microbiology，2003，80 （2）：171-176.

［10］张蔚，杨雪鹏，魏东芝，等.β-葡萄糖苷酶高产菌株的筛选及产酶条件优化［J］.河南大学学报:自然科学版，2011，41（2）：174-178.

［11］王斌赟，刘逸寒，李玉，等.β-葡萄糖苷酶高产菌株的筛选及其基因的克隆与表达［J］.化学与生物工程，2012，29（6）：66-70.

［12］张益波，王娟，何欢，等.β-葡萄糖苷酶新型高产菌株筛选及其液态发酵培养基的优化［J］.微生物学通报，2011，38（6）：809-815.

［13］Pérez G，Fariña L，Barquet M，et al.Aquick screening method to identify β-glucosidase activity in native wine yeast strains: application of Esculin GlycerolAgar（EGA）medium［J］. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2011，27 （1）：47-55.

［14］郑芳，曹小芳，张亚玲，等.一株β-葡萄糖苷酶产生菌株的分离鉴定及酶学性质研究［J］.微生物学通报，2012，39（8）：1059-1068.

［15］何平，曾莹，李彦，等.京尼平甙法测定酶活在β-葡萄糖苷酶高产菌株筛选中的应用［J］.饲料工业，2006，27（14）：54-56.

［16］余伟，王宏勋，张晓昱.高产β-葡萄糖苷酶药用真菌菌株的筛选［J］.食品科技，2008，33（7）：10-14.

［17］吴小刚，曾莹，周丽明，等.β-葡萄糖苷酶高产菌的筛选［J］.中国酿造，2005，24（9）：14-16.

［18］岳冬冬，刘新育，徐新慧，等.β-葡萄糖苷酶高产菌株的筛选及其性质研究［J］.河南农业大学学报，2012，46（2）：173-176.

［19］唐德芳，裴小琼，李晓璐，等.黑曲霉β-葡萄糖苷酶的筛选，克隆及表达［J］.应用与环境生物学报，2009，15（3）：423-426.

［20］刘德海，郝益民，岳丹丹，等.一株产β-葡萄糖苷酶菌株的筛选及酶学性质研究［J］.中国酿造，2013，32（6）：47-47.

［21］Wanapu C，Sripunya P，Boonkerd N.Selection of yeast strains containing β-glucosidase for improving wine aroma［J］. Journal ofAgricultural Science and Technology B，2012，2 （6B）：691.

［22］Mateo J J，Peris L，Ibanez C，et al.Characterization of glycolytic activities from non-Saccharomyces yeasts isolated from Bobal musts［J］.Journal of industrial microbiology& biotechnology，2011，38（2）：347-354.

［23］BelancicA，Gunata Z，Vallier M J，et al.β-Glucosidase from the grape native yeast Debaryomyces vanrijiae:purification，characterization，and its effect on monoterpene content of a Muscat grape juice［J］.Journal ofAgricultural and Food Chemistry，2003，51（5）：1453-1459.

［24］Swangkeaw J，Vichitphan S，Butzke C E，et al. Characterization of β-glucosidases from Hanseniaspora sp. and Pichia anomala with potentially aroma-enhancing capabilities in juice and wine［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2011，27（2）：423-430.

［25］SabelA，Martens S，PetriA，et al.Wickerhamomyces anomalusAS1:a new strain with potential to improve wine aroma［J］.Annals of Microbiology，2014，64（2）：483-491.

［26］López S，Maicas S.Characterisation of Hanseniaspora isolates with potential aroma-enhancing properties in Muscat wines［J］.SouthAfrican Journal of Enology and Viticulture，2014，35（2）：109-115.

［27］Barbagallo R N，Spagna G，Palmeri R，et al.Selection，characterization and comparison of β-glucosidase from mould and yeasts employable for enological applications［J］.Enzyme and Microbial Technology，2004，35（1）：58-66.

［28］张超，李艳宾，张磊，等.纤维素-刚果红培养基鉴定产纤维素酶真菌的机理研究［J］.纤维素科学与技术，2007，15（2）：39-44.

［29］Ünal M Ü，Aksoy VA，ŞenerA.Isolation，purification and determination of some biochemical properties of β-glucosidase from Muscat of Bornova grape［J］.European Food Research and Technology，2014，238（1）：9-15.

［30］Gueguen Y，Chemardin P，Janbon G，et al.Avery efficient β-glucosidase catalyst for the hydrolysis of flavor precursors of wines and fruit juices［J］.Journal ofAgricultural and Food Chemistry，1996，44（8）：2336-2340.

［31］梁华正，刘富梁，彭玲西，等.京尼平苷为底物测定β-葡萄糖苷酶活力的方法［J］.食品科学，2006，27（4）：182-185.

［32］陈守文，陈九武，赵山，等.利用黑曲霉β-葡萄糖苷酶改善葡萄酒的风味［J］.中国酿造，1993（3）：17-19.

［33］Tull D，Withers S G，Gilkes N R，et al.Glutamic acid 274 is the nucleophile in the active site of a“retaining”exoglucanase from Cellulomonas fimi［J］.Journal of Biological Chemistry，1991，266（24）：15621-15625.

［34］Gräbnitz F，Seiss M，Rücknagel K P，et al.Structure of the β-glucosidase gene bglAof Clostridium thermocellum［J］. European Journal of Biochemistry，1991，200（2）：301-309.

［35］González-Pombo P，Fariña L，Carrau F，et al.Anovel extracellular β-glucosidase from Issatchenkia terricola: Isolation，immobilization and application for aroma enhancement of white Muscat wine［J］.Process Biochemistry，2011，46（1）：385-389.

［36］宋娜娜，宋向阳，连之娜，等.纤维素酶液中β-葡萄糖苷酶的分离纯化［J］.南京林业大学学报：自然科学版，2011，35（4）：111-116.

［37］郑淑霞，沈志扬，刘树滔，等.黑曲霉发酵粉中一种β-葡萄糖苷酶的分离纯化与表征［J］.福州大学学报：自然科学版，2004，32（1）：101-105.

［38］孟宪文，李长彪，刘长江，等.乳酸菌β-葡萄糖苷酶的分离纯化及特性研究［J］.食品科学，2007，27（11）：116-119.

［39］石贤爱，张利，刘震，等.南日鲍β-葡萄糖苷酶分离纯化及表征［J］.福州大学学报：自然科学版，2014（3）：480-485.

［40］祝霞，盛文军，杨学山，等.红佳酿酵母β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质［J］.食品科学，2014，13：031.

［41］Jing P，Bomser JA，Schwartz S J，et al.Structure-function relationships of anthocyanins from various anthocyanin-rich extracts on the inhibition of colon cancer cell growth［J］. Journal ofAgricultural and Food Chemistry，2008，56（20）：9391-9398.

［42］董海宝.生物化工［M］.北京：化学工业出版社，2001：287-296.

［43］Gueguen Y，Chemardin P，Pien S，et al.Enhancement of aromatic quality of Muscat wine by the use of immobilized β-glucosidase［J］.Journal of Biotechnology，1997，55（3）：151-156.

［44］Matthijs G，Schacht E.Comparative study of methodologies for obtaining β-glucosidase immobilized on dextran-modified silica［J］.Enzyme and Microbial Technology，1996，19（8）：601-605.

［45］王瑾，李默馨，李红玲，等.壳聚糖/海藻酸钠固定化β-葡萄糖苷酶的研究［J］.食品工业科技，2009（3）：164-167.

［46］Williams P J，Strauss C R，Wilson B，et al.Studies on the hydrolysis of Vitis vinifera monoterpene precursor compounds and model monoterpene.beta.-D glucosides rationalizing the monoterpene composition of grapes［J］. Journal ofAgricultural and Food Chemistry，1982，30（6）：1219-1223.

［47］Voirin S G，Baumes R L，Bitteur S M，et al.Novel monoterpene disaccharide glycosides of Vitis vinifera grapes ［J］.Journal ofAgricultural and Food Chemistry，1990，38（6）：1373-1378.

［48］Winterhalter P，Skouroumounis G K.Glycoconjugated aroma compounds:occurrence，role and biotechnological transformation［M］//Biotechnology ofAroma Compounds. Berlin:Springer，1997：73-105.

［49］Maicas S，Mateo J J.Hydrolysis of terpenyl glycosides in grape juice and other fruit juices:a review［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2005，67（3）：322-335.

［50］Palomo E S，Pérez-Coello M S，Díaz-Maroto M C，et al. Contribution of free and glycosidically-bound volatile compounds to the aroma of muscat“a petit grains”wines and effect of skin contact［J］.Food Chemistry，2006，95（2）：279-289.

［51］Fernández-González M，Di Stefano R，BrionesA.Hydrolysis and transformation of terpene glycosides from muscat must by different yeast species［J］.Food Microbiology，2003，20（1）：35-41.

［52］Palmeri R，Spagna G.β-Glucosidase in cellular and acellular form for winemaking application［J］.Enzyme and Microbial Technology，2007，40（3）：382-389.

［53］Cordero Otero R R，Ubeda Iranzo J F，Briones-Perez A I，et al. Characterization of the β-glucosidase activity produced by enological strains of non-Saccharomyces yeasts［J］.Journal of Food Science，2003，68（8）：2564-2569.

［54］Wang Y，Zhang C，Li J，et al.Different influences of β-glucosidases on volatile compounds and anthocyanins of Cabernet Gernischt and possible reason［J］.Food Chemistry，2013，140（1）：245-254.

［55］Vernocchi P，Ndagijimana M，Serrazanetti D I，et al.Use of Saccharomyces cerevisiae strains endowed with β-glucosidase activity for the production of Sangiovese wine ［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2011，27（6）：1423-1433.

Research Progress in Enzymatic Properties of β-D-glucosidase Produced by Yeast and Its Effects on Wine Aroma

ZHOU Lihua1，MOU Dehua1and LI Yan1，2
（1.College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang，Hebei 050018；2.Hebei R&D Center for Fermentation Engineering，Shijiazhuang，Hebei 050018，China）

In this paper，the screening of β-D-glucosidase-producing yeast strains and its molecular identification were introduced.The physiochemical properties，the separation，the purification and the immobilization of β-D-glucosidase were reviewed.Especially，the application of β-D-glucosidase in enhancing wine aroma was discussed.

yeast；β-D-glucosidase；wine；aroma

TS262.6；TS261.1；TS261.4

A

1001-9286（2016）09-0099-06

10.13746/j.njkj.2016142

2016-04-22；

2016-06-21

周立华（1988-），男，在读硕士研究生，研究方向：传统发酵工程创新技术研究。

李艳（1958-），女，教授，河北省发酵工程重点学科学术带头人，河北省发酵工程技术研究中心学术带头人，研究方向：传统发酵工程创新技术研究、葡萄酒和果酒酿造。

优先数字出版时间：2016-07-26；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160726.1242.001.html。