一种野山参微量DNA的提取方法

孙薛蛟, 骆红梅

(1.贵阳中医学院，贵州贵阳 550002；2.贵阳中医学院第二附属医院，贵州贵阳 550001)



一种野山参微量DNA的提取方法

孙薛蛟1, 骆红梅2*

(1.贵阳中医学院，贵州贵阳 550002；2.贵阳中医学院第二附属医院，贵州贵阳 550001)

[目的]通过优化CTAB提取法从少量的野山参须根提取DNA，使其保持野山参形态的完整。[方法]综合比较CTAB 提取法及其他3种DNA提取法，筛选出较为适合少量药材DNA的提取方法。[结果]从5 mg人参根须提取DNA，栽培参DNA浓度为200～1 000 ng/μL，野山参为50～100 ng/μL，电泳可检测到清晰的条带，满足浓度和纯度的要求。[结论]该研究采用改进的高盐SDS法能从5 mg微量人参须根材料中提取高质量DNA，满足浓度和纯度的要求，可作为其他药材微量组织提取DNA 的参考方法。

栽培参；野山参；DNA提取

自20世纪50年代提出DNA双螺旋模型以来，分子生物学的研究进入了新的高度。而DNA提取是分子生物学研究的关键步骤，同时DNA 质量的好坏关系到后续工作的成功与否。目前，DNA 提取方法较多[1]，针对试验目的而有所差异，就植物本身而言，目前较为通用的方法是CTAB(cetyl triethyl ammonium bromide) 法[2-3]。该方法提取的DNA 纯度较高；但植物成分复杂多样，不适用于微量DNA的提取。而针对珍稀药材野山参的遗传多样性和DNA 进行指纹鉴定，有必要研究微量材料的DNA 提取方法，以便从少量须根提取DNA 而不破坏野山参的整体形态。笔者改进了DNA提取方法，设计了一种简便的DNA提取方案，通过收率和DNA质量与经典CTAB法进行比较以期为其他药材微量组织DNA的提取方法提供参考。

1　材料与方法

1.1试验材料栽培人参(PanaxginsengC. A. Mey.)，5个野山参标本参龄为40～50年，均来自吉林省抚松县，由王志民教授鉴定。用栽培参的材料比较DNA提取方法和RAPD扩增的效果，然后用效果最好的方法提取5个野山参样品加以验证。

1.2DNA 提取方法

1.2.1经典的CTAB方法。称取0.005 g干燥须根液氮研磨，预加热至 65 ℃，2×CTAB(2%CTAB，100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，20 mmol/L EDTA，1.4 mmol/L NaCl)缓冲液600 μL，65 ℃水浴1 h，不断振荡混匀，用等体积氯仿∶异戊醇(V/V=24∶1)抽提，11 000 r/min离心30 s，上清加入1/10体积10%CTAB/NaCl混匀，加等体积氯仿∶异戊醇(V/V=24∶1)混匀，11 000 r/min离心30 s，取上清加等体积1×CTAB沉淀缓冲液混匀，60 ℃ 保温30 min，11 000 r/min离心10 min，沉淀溶于2 μL高盐TE溶液，加等体积预冷无水乙醇，-20 ℃保存30 min以上，10 000 r/min离心10 min，70%乙醇洗2遍，沉淀在室温下干燥，溶于50 μL 0.1×TE，加入1 μL RNase(10 μg/μL)，于65 ℃保温30 min。

1.2.2改良的CTAB方法。称取0.005 g干燥人参须根液氮研磨，吸入600 μL于65 ℃预热的CTAB抽提液，65 ℃水浴1 h，不断振荡混匀， 用等体积氯仿∶异戊醇(V/V=24∶1)抽提，10 000 r/min离心10 min。此步骤可以用酚∶氯仿∶异戊醇溶液(V/V/V=25∶24∶1)或氯仿∶异戊醇(V/V=24∶1)重复抽提一次。取上清液加入1/10(V/V)的NaAc(3 mol/L)，加入2倍体积的无水乙醇。混匀后于-20 ℃保存30 min或更长时间，10 000 r/min离心15 min，沉淀物用500 μL 70%乙醇洗涤，沉淀55 ℃烘干，溶于50 μL灭菌水中，加入1 μL RNase(10 μg/μL)，于65 ℃保温30 min。所得基因组DNA于-20 ℃保存。

1.2.3SDS裂解的高盐低pH方法。称取0.005 g干燥人参须根液氮研磨，吸入600 μL于65 ℃预热的SDS抽提液，然后在65 ℃水浴中保温45 min，期间每5 min颠倒混匀一次。加入相当于其2/3体积的KAc溶液(2.5 mol/L，pH 4.8)，颠倒3次混匀。混合物在冰上静置30 min，8 000 r/min离心6 min，取上清液加入1/10(V/V)的NaAc(3 mol/L)，再加入0.6倍体积的异丙醇，混匀后于-20 ℃保存30 min或更长时间。10 000 r/min离心15 min，沉淀物用500 μL 70%乙醇洗涤，沉淀55 ℃烘干，溶于50 μL灭菌水中，加入1 μL RNase(10 μg/μL)，于65 ℃保温30 min。所得基因组DNA于-20 ℃保存。1.2.4改进的高盐SDS方法。称取0.005 g干燥人参须根液氮研磨，吸入600 μL于65 ℃预热的SDS抽提液(100 mmol/L NaAc，50 mmol/L NaCl，2% PVP，1.4% SDS，pH调至5.5，使用前加入2%的β-巯基乙醇)，然后在65 ℃水浴中保温45 min，期间每5 min颠倒混匀一次。自水浴中取出后，静置至室温。6 000 r/min离心5 min，取上清液，加入相当于其2/3体积的KAc溶液(2.5 mol/L，pH为4.8)，颠倒3次混匀。混合物在冰上静置30 min，然后8 000 r/min离心6 min，取上清液，加入等体积的氯仿∶异戊醇(V/V=24∶1)充分混匀，8 000 r/min离心6 min，取上清液，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀后于-20 ℃保存1 h或更长时间。10 000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀物在55 ℃烘箱中烘干，溶于50 μl灭菌水，加入1 μL RNase(10 μg/μL)，于65 ℃保温30 min。补充450 μL灭菌水，加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇溶液(V/V/V25∶24∶1)，充分混匀，10 000 r/min离心10 min，取上清液加入1/10(V/V)的NaAc(3 mol/L)，加入2倍体积的无水乙醇。混匀后于-20 ℃保存30 min或更长时间，10 000 r/min离心15 min，沉淀物用500 μL 70%乙醇洗涤，沉淀55 ℃烘干，溶于50 μL灭菌水中。所得基因组DNA于-20 ℃保存。

2　结果与分析

2.1采用经典的CTAB方法抽提的人参DNA采用该方法得到的DNA含量甚低，电泳检测不到，分光光度计也未检测到。

2.2采用改良的CTAB方法抽提的人参DNA采用该方法得到的DNA沉淀物呈透明胶状物质，可能为多糖类物质。分光光度计检测栽培参DNA浓度达50～200 ng/μL。采用逐级稀释DNA的方法进行PCR， 得到的条带均较弱，重复试验发现条带不稳定，说明DNA得率不高且含有杂质干扰扩增。如果采用4×CTAB或6×CTAB做抽提液，因黏稠不易与材料充分混匀，需要提高水浴时间，但会增加DNA的降解，电泳检测发现拖尾现象严重(图1)。

图1　高浓度CTAB抽提的栽培参总DNA电泳图谱Fig.1　Extraction of total DNA of cultivated ginseng by high concentration CTAB method

2.3采用SDS裂解的高盐低pH方法抽提的人参DNA采用该方法得到的DNA沉淀物较多，但不透明，为浅黄色甚至黄褐色，可能是色素未除净或抽提过程中酚类物质氧化。电泳检测发现栽培参有清晰的主带，但点样孔中有多糖或者蛋白质残留。分光光度计检测栽培参DNA浓度在200 ng/μL以上，但纯度较差。采用逐级稀释DNA方法进行PCR，发现稀释10～100倍后才能扩增出较亮条带，且不稳定，说明该方法虽然DNA得率高但含有较多杂质干扰扩增(图2)。

图2　SDS裂解的高盐低pH法抽提的栽培参总DNA电泳图谱Fig.2　Extraction of total DNA of cultivated ginseng by improved high salt SDS and low pH method

图3　改进的高盐SDS法抽提的栽培参的基因组DNA电泳图谱Fig.3　Extraction of the genomic DNA of wild ginseng by improved high salt SDS method

图4　改进高盐SDS法抽提的野山参基因组DNA电泳图谱Fig.4　Extraction of the genomic DNA of wild ginseng by improved high salt SDS method

2.4采用改进的高盐SDS方法抽提的人参DNA采用该方法得到的DNA沉淀物为无色透明，电泳可检测到清晰的条带。分光光度计检测，栽培参DNA浓度为200～1 000 ng/μL，野山参浓度为50～100 ng/μL。PCR可得到明亮、稳定的条带，满足浓度和纯度的要求。野山参与栽培参比较，DNA得率低，电泳检测主带不清晰，有大量弥散的小片段(图3、4)。

3　结论与讨论

该试验利用SDS抽提方法高收率的优点，并增加了适当的步骤去除杂质，以避免SDS抽提方法纯度不高的缺点。去除杂质的步骤只是适当增加，否则不仅会使得率大大降低，也会使基因组的完整性遭到破坏。

SDS抽提液中加入5%聚乙烯吡咯呤酮(PVP)，其CO-N-基有很强的多酚化合物结合能力，且随着多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强，在苯酚和氯仿抽提时除去，可防止酚类化合物被释放且氧化后与总DNA结合产生褐化效应，导致总DNA的活性丧失以及在用苯酚氯仿抽提时的丢失。加入KAc溶液前离心去除残渣，可使KAc溶液充分作用使得蛋白质变性。先后使用氯仿∶异戊醇(V/V=24∶1)和酚∶氯仿∶异戊醇溶液(V/V/V=25∶24∶1)抽提，使蛋白质去除更彻底，在高盐低pH条件下，也可除去一些多糖。采用二次沉淀办法，去除杂质更彻底，一次沉淀用异丙醇，DNA沉淀的得率高但杂质较多，二次沉淀用无水乙醇，DNA沉淀得率相对较低，但杂质少，注意在-20 ℃下沉淀1 h以上甚至过夜会得到较多DNA，如果离心后发现无任何沉淀，可以继续放入冰箱沉淀或加大离心速度和时间。

野山参由于生长年份长、采集过程复杂、保存困难等原因致使样品本身DNA降解较多，获取的基因组DNA质量不高。栽培参相对于野山参而言DNA提取较易，而且无论是野山还是栽培参各样品间的DNA提取难易程度不一，表明人参样品的采集、加工和保存等与DNA质量关系密切。

[1] FU R Z, SUN Y R, JIA S R. Plant genetic transformation technical manuals[M].Beijing: China Science and Technology Publishing House, 1994:131.

[2]SCOTT O R, ARNOLD J B. Extraction of DNA from milligram amount s of fresh[J].Herbarium and mummified plant tissues plant molecular biology, 1985, 5: 69.

[3]GU H Y, QU L J, MING X T,0et al.plant genetic and molecular operation[M].Beijing: Peking University Press, 1995:19.

A Kind of Wild Ginseng Trace DNA Extraction Method

SUN Xue-jiao1, LUO Hong-mei2*

(1. Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang, Guizhou 550002; 2. The Second Affiliated Hospital of Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang, Guizhou 550001)

[Objective] The aim was to optimize CTAB method for DNA extraction from a small amount of fibrous roots of wild ginseng to keep the integrity form of wild ginseng. [Method] CTAB extraction method and other three kinds of DNA extraction method were comprehensively compared, CTAB method which is suitable for DNA extraction from a small amount of medicinal herbs was selected. [Result] DNA was extracted from 5 mg ginseng root, the concentration of cultivated ginseng DNA was 200-1 000 ng/μL, wild ginseng was 50-100 ng/μL, electrophoresis can detect clear strip, meet the requirements of the concentration and purity. [Conclusion] The improved high salt SDS method can extract high quality DNA from 5 mg trace ginseng fibril material. This method meet the requirements of the concentration and purity, and can be the reference method for extracting DNA from other medicinal materials.

Cultivated ginseng; Wild ginseng; DNA extraction

孙薛蛟(1990- )，男，重庆丰都人，硕士研究生，研究方向：中药化学成分及中药新药研究。*通讯作者，副主任药师，从事医院药学、医院制剂研究。

2016-07-18

S 188

A

0517-6611(2016)24-155-02