养殖大菱鲆腹水病病原菌的分离与鉴定

景亚运， 张 正， 王印庚， 于永翔， 廖梅杰， 李 彬

(1.大连海洋大学水产与生命学院，辽宁大连116023；2.中国水产科学研究院黄海水产研究所,青岛海洋科学与技术国家实验室，海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东青岛 266071)



养殖大菱鲆腹水病病原菌的分离与鉴定

景亚运1,2， 张 正2*， 王印庚2， 于永翔2， 廖梅杰2， 李 彬2

(1.大连海洋大学水产与生命学院，辽宁大连116023；2.中国水产科学研究院黄海水产研究所,青岛海洋科学与技术国家实验室，海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东青岛 266071)

[目的]从养殖大菱鲆中分离腹水病病原菌，并对其进行鉴定。[方法]从山东半岛2个不同的养殖场腹水病发病大菱鲆体内分离病原菌，并通过常规生理生化试验和16S rDNA基因序列对比对其进行鉴定。[结果]共分离到2株优势细菌。常规生理生化特征分析表明，这2株菌分别与鲨鱼弧菌(Vibriocarchiariae)和大菱鲆弧菌(Vibrioscophthalmi)表性特征非常相似。系统发育树分析表明这2株菌与鲨鱼弧菌(Vibriocarchiariae)和大菱鲆弧菌(Vibrioscophthalmi)的亲缘关系最近。[结论]这2株细菌被鉴定为鲨鱼弧菌(Vibriocarchiariae)和大菱鲆弧菌(Vibrioscophthalmi)。

大菱鲆；腹水病；病原；鲨鱼弧菌；大菱鲆弧菌

大菱鲆(ScophthalmusmaximusL)隶属鲆科菱鲆属，是水产品市场广受欢迎的一种名贵鱼种，经济价值很高[1]。我国从1992年开始进行大菱鲆的引种工作，并于2001年开始进行大规模的商业养殖。但是，近几年随着大菱鲆养殖热潮的兴起，养殖规模迅速扩大，疾病的暴发也越来越频繁[2-4]。通过对养殖大菱鲆进行系统的流行病学调查研究，发现腹水病是养殖大菱鲆最为常见的细菌性疾病之一。笔者从3个分布于山东半岛不同区域的养殖场采集了病鱼的样品，进行了细菌分离和病原的系统发育学研究。

1　材料与方法

1.1菌种的采集、分离和培养基从位于青岛和荣成2个不同的养殖场采集到2个患腹水病的大菱鲆样品，这2个样品病鱼外观胸腔鼓胀、腹部隆起，解剖后发现胸腔内部充满无色或淡黄色液体，腹水病的病变症状非常明显。

在无菌条件下，将发病鱼的肝脏组织剪碎后用接种环直接挑取并接种于盐度为3%的TSB(胰蛋白胨大豆肉汤)平板培养基上，28 ℃下培养24～30 h后，挑取优势菌的单个菌落纯化2遍后，用20%甘油置于-80 ℃冰箱中保存。腹水中的细菌则是使用一次性无菌医用注射器吸取少量腹水直接接种于盐度为3%的TSB平板培养基上，采用相同的方法分离和保存。TSB(胰蛋白胨大豆肉汤)培养基的成分为：胰蛋白胨17 g，植物蛋白胨3 g，NaCl 30 g，磷酸氢二钾25 g，葡萄糖25 g，蒸馏水1 000 mL，121 ℃下高压灭菌15 min。

1.2形态观察和生理生化试验使用Nikon E800光学显微镜观察细菌个体形态、大小和鞭毛，用半固体培养基(TSB)穿刺接种培养结合水浸片观察细菌运动性。参照《伯杰氏细菌鉴定手册(第9版)》对细菌进行常规分类，用法国生物梅里埃公司API 20E试剂条和北京陆桥公司的菌种鉴定管进行常见碳、氮源利用和酶反应的测定，对于一些特征性反应则手工配制相应培养基进行。

1.316S rDNA序列测定分析

1.3.1PCR模板的制备。将细菌分别接种于TSB平板上，28 ℃下培养24 h后取单一菌落悬浮于无菌去离子水中，100 ℃水浴5～10 min后，4 ℃下12 000 r/min离心10 min，上清液即为PCR扩增反应的模板。

1.3.216S rDNA基因序列的PCR扩增和序列测定。16S rDNA基因扩增的正向引物(P27f)为5’-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTC AG-3’，反向引物(P1429r)为5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’(此引物为细菌16S rDNA基因序列扩增的通用引物)。PCR扩增体系(100 μL)：1×PCR缓冲液、1.5 mmol/L MgCl2、4×dNTP混合物125 μmol/mL、引物各7.5 nmol/mL、TaqDNA聚合酶1 μL (5 U/μL)、1 μL DNA原液。PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸100 s，35个循环；最后72 ℃温育15 min。PCR产物经过琼脂糖电泳确定特异条带后，直接交由上海生物工程技术公司进行PCR产物纯化和序列测定。

1.3.3序列分析和系统发育树的构建。将所获得的16S rDNA基因序列使用BIOEDIT软件进行对比分析，确定其相似性。从GenBank中选取与其相似率最高的细菌16S rDNA基因序列，使用BIOEDIT软件中集成的Clustal W软件进行多序列匹配排列，使用系统发生推断软件包PHYLIP3.6a3进行统计和聚类分析。采用邻位相连法(Neighbor-joining)获得系统发育树，通过自举分析(Bootstraping)进行系统进化树的评估，自举数据集为1 000次。

1.3.4构建系统发育树的16S rDNA基因序列来源。从GenBank数据库中选取25株与分析细菌的16S rDNA基因序列相似性较高的已鉴定至种的菌株，与分离到的菌株共同构建系统发育树。选取菌株的相关数据和存取号见表1。

表1　构建系统发育树的16S rDNA基因序列及其数据库存取号

2　结果与分析

2.1形态特征和运动性从这2个病鱼样品中分离到2株优势细菌，分别编号为菌株Ⅶ和菌株Ⅸ。这2株菌在盐度3%的TSB培养基上28 ℃下培养24～30 h后，形成的单个菌落均较小、透明、接近无色。水浸片显微检查和半固体琼脂穿刺接种培养都发现菌株Ⅶ有较强的运动性，菌株Ⅸ没有明显的运动性。在TCBS琼脂平板培养基上，菌株Ⅶ和菌株Ⅸ都呈明显黄色的菌落。

2.2生长特性这2株菌的温度生长范围存在差异，菌株Ⅶ在10～40 ℃范围内都能生长，并且在此范围内没有表现太大的生长速度差异。菌株Ⅸ在10～30 ℃范围内能良好地生长，在30～40 ℃范围内可以微弱生长。

在盐度1%～5%的范围内，这2株细菌生长非常良好，在此范围外表现出一定的盐度生长差异性。当pH高于6.5时，它们都能够良好生长，说明这2株细菌都是嗜碱性的。

2.3生理生化特征由表2可知，这2株细菌明显不是同一种细菌。它们在 TCBS平板生长旺盛，且菌落都呈明显黄色，对O/129特征性抑制剂敏感，据此可将它们归为弧菌属细菌。通过查阅相关文献发现，菌株Ⅶ在一些主要指标上与鲨鱼弧菌(Vibriocarchariae)非常相近，菌株Ⅸ与大菱鲆弧菌(Vibrioscophthalmi)的生理生化特征非常相似。

表2　分离菌株的主要生理生化特征

注：+ 表示阳性；- 表示阴性；(+)表示弱阳性生长[5]。

Note：+ indicated positive; - indicated negative; and (+) indicated the growth of weak positive[5].

2.416S rDNA基因序列分析和系统发育树的构建将获得的16S rDNA序列使用DNAMAN软件进行比对，发现它们的相似率为93.98%。综合上述生理生化试验结果，可以确定这2株细菌同属不同种。将这2株细菌的16S rDNA基因序列分别输入NCBI GenBank数据库中进行相似性检索，结果发现与菌株Ⅶ相似性最高的前100个序列中65%为弧菌属细菌，与其最相近的已鉴定的细菌16S rDNA序列是鲨鱼弧菌(Vibriocarchiariae)的16S rDNA序列，相似率为99.71%。与菌株Ⅸ相似性最高的前100个序列中84%为弧菌属细菌，与其相似率最高的已鉴定的细16S rDNA序列是大菱鲆弧菌(Vibrioscophthalmi)的16S rDNA序列，相似率为99.37%。

从GenBank数据库中选取与菌株Ⅶ和菌株Ⅸ的16S rDNA序列相似性较高的13株细菌的16S rDNA序列(表1)进行系统发育学分析，并构建系统发育树。从图1可以看出，B7(菌株Ⅶ)与V.carchiariae自然聚类成一个分支，B9(菌株Ⅸ)与V.scophthalmi自然聚类成一个分支[6]。综合生理生化试验结果和16S rDNA系统发育学分析，可初步鉴定这2株从患腹水病的大菱鲆体分离到的优势细菌中1株为鲨鱼弧菌(Vibriocarchiariae)，另1株为大菱鲆弧菌(Vibrioscophthalmi)。

注：基于16S rDNA基因序列用邻位相连法完成，分枝上的数字是1 000次重复抽样检测的Bootstrap值。　Note: Based on 16S rDNA sequence with Neighbor-joining method, the digit on the ramification was bootstrap valuation of 1 000 replications of sampling detection.图1　16S rDNA基因序列的聚类分析结果Fig.1　Cluster analysis result of 16S rDNA gene sequence

3　讨论

流行病调查表明，腹水病是养成期大菱鲆的常见疾病，流行面积较广，在环渤海沿岸和山东半岛以及江苏省等大菱鲆的主要养殖区都发生过。对腹水病的病原学初步研究表明，细菌是导致腹水病发病的主要原因。腹水病发病初期属于内脏器官的病变，发病中后期则会导致全身感染，并可导致大规模的死亡，发病后具有非常典型的外观病变特征，在养殖生产中若注意观察是比较容易发现和识别的[7]。

腹水病属于内脏器官的病变，其发病机理是比较复杂的[8]。针对来源不同的样品，对腹水病进行的细菌分离也证实了这一点。从腹水病发病病鱼的内脏组织和腹腔积水中分离到鲨鱼弧菌和大菱鲆弧菌，此外还有1株待鉴定的细菌。从病原学研究来看，推测腹水病可能是多种病原都能致病。

鲨鱼弧菌是国外的一些相关文献报道的对大菱鲆致病的常见病害细菌之一[9]，国内莫照兰等[10]也报道了鲨鱼弧菌可对养殖牙鲆致病。目前在我国对养殖大菱鲆的病害研究还相对较少，尽管已经从发病的大菱鲆体内检测到鲨鱼弧菌，并已证实在腹水病患病状态下这种弧菌属于优势菌群，但对于这2种弧菌的入侵方式、致病力以及是原发病原还是继发病原都尚需深入研究。据国外文献报道，大菱鲆弧菌是大菱鲆幼苗期肠道中占优势数量的一种细菌，正常情况下并无致病性[11]。在来自不同地理区域的大菱鲆样品肠道中都可检出大菱鲆弧菌；在一些育苗场的水体中和活饵体内，也曾检出大菱鲆弧菌，但在养殖池底的沉积物中并不常见[12]。因此，推断大菱鲆弧菌可能是健康大菱鲆肠道中的正常优势菌群，但在大菱鲆内脏器官被感染或其他病原细菌入侵后可能转变为条件致病菌，应属于继发性病原。但是对于该菌一些病原学方面的具体特性还有待进一步研究。此外，在来自其他地区的患腹水病的大菱鲆样品中还分离到1株已证实为非弧菌属的细菌，通过对其生理生化特征和16S rDNA基因序列的研究，并未找到相似性很高的已知菌种，今后对这株细菌的鉴定和相关病原学方面的研究也将逐渐开展。

由于试验成本和试验条件的限制以及腹水病的发病机理本身具有复杂性，尚未完成对腹水病的人工回接感染试验。该试验中所分离的这些细菌来自不同的养殖场，具有一定的代表性，它们极有可能是这2种疾病的第一致病原或继发性病原。根据这些细菌的多样性推测，它们也存在联合致病的可能性。腹水病是大菱鲆养殖过程中极为常见的一种细菌性疾病，由于是内部器官的感染，发病前期没有明显的症状，给生产上及时发现和预防该病造成了一定的困难[13]。因此，选购健康的苗种、规范健康养殖工艺和加强卫生操作管理防治腹水病的有效措施。

[1] 雷霁霖，刘新富.大菱鲆Scophthalmusmaximus引进养殖的初步研究[J].现代渔业信息，1995，10 (11): 1-3.

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[4] 张正，王印庚，韩文君，等.养殖大菱鲆烂鳍病病原菌的鉴定及系统发育学研究[J].海洋科学进展，2004(4):193-197.

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[13] 丁春林, 李文全, 张健,等.工厂化养殖大菱鲆肠炎病、腹水病防治技术探讨[J].河北渔业, 2014(1):46-47.

Isolation and Identification of Pathogenic Bacterium Associate with Ascites Disease of CulturedScophthalmusmaximus

JING Ya-yun1,2, ZHANG Zheng2*,WANG Yin-geng2et al

(1. College of Fisheries and Life Science, Dalian Ocean University, Dalian, Liaoning 116023; 2.Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao, Shandong 266071)

[Objective] To isolate and identify pathogenic bacterium associate with ascites disease of culturedScophthalmusmaximus. [Method] Pathogenic strains were isolated from three diseased-turbot samples associate with ascites syndrome in three different aquatic plants on Shandong Peninsula. The traditional physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequencing analysis were performed on the two strains. [Result] A total of two dominant bacterium were isolated. Analysis of traditional physiological and biochemical test showed that the two strains wereVibriocarchiariaeandVibrioscophthalmi. Analysis of phylogenetic dendrogram showed that the two strains had close genetic relationship withVibriocarchiariaeandVibrioscophthalmi. [Conclusion] The two strains were identified asVibrioalginolyticusandVibrioscophthalmi.

Scophthalmusmaximus; Enteritis diseases; Pathogeny;Vibrioalginolyticus;Vibrioscophthalmi

山东省自主创新与成果转化专项(2014ZZCX06205)。

景亚运(1990- )，男，河北任丘人，硕士研究生，研究方向：海水养殖病害研究。*通讯作者，副研究员，博士，硕士生导师，从事海水养殖病害研究。

2016-06-29

S 94

A

0517-6611(2016)24-106-03