具有解钾活性假单胞菌的分离与鉴定

罗 雯， 石路怀

(1.南昌师范学院生物系，江西南昌 330032；2.西安文理学院生物与环境工程学院，陕西西安 710065)



具有解钾活性假单胞菌的分离与鉴定

罗 雯1, 2， 石路怀1

(1.南昌师范学院生物系，江西南昌 330032；2.西安文理学院生物与环境工程学院，陕西西安 710065)

[目的]分离并鉴定具有解钾活性假单胞菌。[方法]以农田土壤为样本，在钾长石粉为唯一钾源的选择性培养基上分离并纯化解钾菌，并通过形态观察和16S rDNA序列分析对分离到的细菌进行鉴定。[结果]经梯度稀释涂布和平板划线分离，经初筛获得8株生长良好并具有解钾透明圈的细菌。将初筛后获得的细菌菌株进行发酵培养，利用原子吸收分光光度法测定发酵上清液中的速效钾含量，从中筛选出解钾能力较强的1株假单胞菌K3。通过形态观察发现，该菌株为革兰氏阴性杆菌。16S rDNA序列分析结果表明，该菌株与荧光假单胞菌F113亲缘关系最近，初步确定该菌株属假单胞菌属。[结论]该研究为微生物钾肥的开发提供了新的试材。

解钾菌；分离；鉴定；假单胞菌

钾在植物体内占干物质量的0.2%～4.1%，仅次于氮，是肥料三要素之一。据土壤普查资料可知，我国耕地缺钾面积约占70%，其中严重缺钾的耕地约占45%[1]。按照平均施肥的概念，根据中国土壤状况，我国农业部门推荐的氮、磷、钾施肥比例为1∶0.4∶0.3，但目前我国肥料中实际比例仅为1∶0.37∶0.17，远小于发达国家的氮、磷、钾施肥比例(1∶0.5∶0.4)，肥力不足已经成为限制作物产量和品质提高的重要因素之一[2-3]。

经过50多年的发展，我国钾盐钾肥工业取得了巨大的成效，但钾资源相对匮乏的状况依然未能改变[4-6]。美国地质调查局数据表明，我国已探明的钾盐资源仅占世界总储量的2.21%，且分布不均，这一状况严重限制了我国钾肥的开发与利用。2013年我国钾肥总产量不到世界总产量的1/10，钾肥消费量却接近世界消费总量的1/6，钾盐已经成为我国7种大宗紧缺矿产之一[7-8]。探索钾肥高效利用的措施和替代技术，对于解决我国钾肥对外依赖度高的问题以及保证我国农业生产安全具有重要意义。

已有很多学者的研究表明，土壤中存在的大量解钾菌可以将不溶性的钾转化为可溶性钾，被植物吸收利用；同时，有些解钾菌还能分泌不同的植物激素，起到促进植物生长与改善土壤微环境的作用[9-10]。由于微生物菌株具有无毒、无污染等优点，所以能克服过量施用化肥对生态环境带来的负面影响。因此，从土壤中分离获得解钾菌并进一步开发成微生物钾肥，对于解决我国农田土壤缺钾现状并促进农业生产具有重要意义。笔者从陕西省西安市农田土壤采集土样，分离并筛选到1株解钾菌，并通过16S rDNA序列分析对其进行鉴定。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1培养基。

1.1.1.1筛选培养基。每100 g培养基中含有蔗糖0.5 g、Na2HPO40.2 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、FeCl30.000 5 g、CaCO30.01 g、钾长石粉0.1 g(去离子水5次清洗)、琼脂2.0 g，pH 7.0～7.5，121 ℃灭菌15 min后备用。

1.1.1.2发酵培养基。每100 g培养基中含蔗糖1.5 g、MgSO4·7H2O 0.02 g、CaSO4·7H2O 0.01 g、NaCl 0.02 g、钾长石粉0.5 g、pH 7.0～7.5、121 ℃下灭菌15 min，备用。

1.1.1.3斜面培养基。每100 g培养基中含牛肉膏0.4 g、蛋白胨1.0 g、NaCl 0.5 g、琼脂2.0 g、pH 7.2～7.5，121 ℃下灭菌15 min后备用。

1.1.2主要仪器。原子吸收分光光度计(AA-6300C型，日本岛津公司)。

1.2方法

1.2.1解钾菌的筛选。准确称取土壤样品1 g，放入装有99 mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中振荡摇匀，梯度稀释，取稀释倍数为10-2和10-4的稀释液涂布于筛选培养基平板上，于28 ℃培养箱中倒置培养2～3 d。选择生长旺盛并具有明显溶钾圈的菌株，采用平板划线法进行3次纯化。根据菌落形态和镜检观察结果，将分离到的菌株编号并斜面扩大培养，保存备用。

1.2.2解钾菌解钾能力的测定。将培养24 h的斜面菌种用6 mL无菌水冲洗后，移取菌液5 mL接种到装有95 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中(含0.5 g钾长石粉)，每个菌株做3个平行，同时以不接菌作为空白对照，28 ℃下200 r/min振荡培养7 d。培养液3 000 r/min离心10 min，并用孔径0.22 μm滤膜过滤，除去菌体和残渣，收集上清液，采用原子吸收分光光度法测定可溶性钾含量，比较不同菌株的解钾能力。

1.2.3解钾菌16S rDNA基因序列分析。使用基因组DNA纯化试剂盒(为Promega公司产品)提取菌体的DNA，将提取物溶于水中，4 ℃下保存备用。16S rDNA基因序列分析采用细菌16S rDNA基因通用引物[11]，以基因组DNA为模板进行扩增，上游引物序列为5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’，下游引物序列为5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR扩增体系(50 μL): 10×TaqBuffer(含Mg2+) 5 μL、dNTP(2.5 mmol/L) 4.0 μL、引物( 25 pmol/μL) 各1 μL、模板DNA 0.5 μL、Taq酶0.5 μL、ddH2O 38 μL。PCR反应条件: 95 ℃预变性5 min、94 ℃变性60 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，循环30次，72 ℃终末延伸10 min;反应结束后4 ℃下保存。PCR产物使用回收试剂盒(Promega产品)纯化，送交上海生工生物工程有限公司进行测序。测序结果在GenBank核酸数据库中进行序列比对，选取同源性较高的序列，使用MEGA 6.06软件，基于邻接法(Neighbor-joining method)构建菌株系统发育进化树。

2　结果与分析

2.1菌落和菌体的基本特征将土壤悬液均匀涂布在筛选培养基上恒温培养，28 ℃下培养2～3 d，挑取菌落大、黏性强、长势良好的菌株，采用平板划线法进行纯化，经初步筛选获得有明显解钾透明圈的8个菌株。将初筛菌株划线培养，28 ℃条件下在筛选培养基上培养48 h，观察菌落特征；同时，挑取菌体进行镜检观察，结果见表1。

2.2速效钾产生能力的检测对初筛的8株菌进行摇瓶解钾试验，测定其释钾效率。取28 ℃下振荡培养7 d的发酵培养液上清，以不接种为对照，采用原子吸收分光光度法测定各菌株发酵培养上清中速效钾含量，结果见图1。

注：NC为阴性对照。Note:NC stands for negative control.图1　各菌株解钾能力的比较Fig.1　Comparison of potassium-releasing abilities of strains

菌株编号Straincode菌落形态Colonymorphology菌体形态Microbialmorphology革兰氏染色GramstainingK1菌落半透明,凸起,乳白色杆状-K2菌落中央白色,边缘透明,稍呈圆形圆形-K3菌落透明,油滴状,中央凸起,圆形长杆状-K4菌落光滑,乳白色,中央小凸起短杆状-K5菌落半透明,边缘光滑,乳白色串联杆状-K6菌落白色,边缘清晰,中央凸起短杆状-K7菌落半透明,中央略厚,边缘不规则串联杆状+K8菌落土灰色,表面光滑,中央隆起长杆状-

图2　K3菌株平板菌落形态(A)及油镜观察结果(B) (100×) Fig.2　Colony morphology(A) and microscopic observation(B) of strain K3 (100×)

所选菌株中K3菌株产生速效钾的能力最强，其培养液中速效钾含量达到4.7 mg/L，与对照(1.1 mg/L)和其他7株菌相比，释钾能力较强。K3菌株的菌落形态及镜检结果见图2。

2.3K3菌株16S rDNA基因序列分析将菌株K3 16S rDNA的测序结果输入GenBank数据库，利用BLAST程序，将测得到的基因序列与GenBank数据库中核酸数据进行同源性分析，获取同源性较高的相邻的种、属的16S rDNA序列，并利用MEGA 6.06软件构建系统发育树。从图3可以看出，K3菌株与荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)F113的亲缘关系最近，序列相似性达到99%，因此可初步鉴定K3菌株属假单胞菌属(Pseudomonassp.)。

图3　K3菌株的16S rDNA系统发育树分析Fig.3　16S rDNA phylogenetic tree of strain K3

3　结论与讨论

笔者从陕西西安农田土壤中利用硅酸盐细菌培养基进行解钾菌的分离与筛选，用是否产生解钾透明圈作为初筛条件，初步分离到8个菌株。但是，对8菌株发酵培养液上清中速效钾含量的变化进行检测，结果却只有K3菌株具有明显的解钾活性，其他菌株发酵液上清中速效钾含量与对照相比没有显著变化。这说明解钾透明圈不能作为判断细菌解钾能力的唯一指标。麻瑞阳[12]研究表明在钾细菌培养基上不产生解钾透明圈的细菌，也有可能具有较高的解钾活性。因此，在解钾菌筛选时应对所有菌落形态饱满的菌株进行进一步解钾活性复筛，以降低漏检的概率。

通过16S rDNA基因序列分析，K3菌株与荧光假单胞菌 F113的序列相似性达到99%，在系统发育树上亲缘关系最近。目前，国际公认的硅酸盐菌种主要包括胶质芽孢杆菌(Bacillusmucilagionsus)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)[13]和土壤芽抱杆菌(Bacillusedaphicus)，均属于芽孢杆菌属。但是，近年来国内外学者已经报道的新分离硅酸盐细菌的分类地位是多样的[14-19]，如固氮菌属(Azotobactersp.)、根瘤菌属(Rhizobiumsp.)、胶质类芽孢杆菌(Paenibacillusmucilaginosus)、伯克氏菌(Burkholderiasp.)等。这些具有较高解钾活性的不同种类细菌充分证明自然界的解钾资源是非常丰富的，该研究结果再次佐证了这个观点。同时，荧光假单胞菌是目前国内外学者在植物病害生物防治领域的研究重点之一[20]。因此，该研究中分离获得的具有较强解钾能力的菌株K3，有待进一步研究。

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Isolation and Identification of a Potassium-releasing Strain ofPseudomonassp.

LUO Wen1, 2, SHI Lu-huai1

(1.Biology Department, Nanchang Normal University, Nanchang, Jiangxi 330032; 2.School of Biological and Environmental Engineering, Xi’an University of Arts and Science, Xi’an, Shaanxi 710065)

[Objective] To isolate and identify a potassium-releasing strain ofPseudomonassp..[Method] With farmland soil as the sample, potassium-releasing bacteria was isolated and purified on the selective medium in which potash feldspar powder was used as the only source of potassium.Morphologic observation and 16S rDNA gene sequence analysis were used to identify the isolated strains.[Result] By using the methods of gradient dilution coating and streaking inoculation, eight presumed potassium-releasing bacteria strains exhibiting clear zones were selected and inoculated into fermentation medium.The potassium contents in supernatant were determined with flame atomic absorption spectrophotometry method.Among them, a strain named K3 was verified to be with relatively high potassium-releasing ability cause the potassium contents in the supernatant of fermentation culture greatly increased comparing to the control sample.Through morphological observation it was verified to be Gram-negative rod bacteria.The 16S rDNA gene sequence analysis result showed that it had most close genetic relationship withPseudomonasfluorescensF113, thus tentatively identified asPseudomonassp..[Conclusion] This research provides new test materials for the development of microbial potash fertilizer.

Potassium bacteria; Isolation; Identification;Pseudomonassp.

南昌师范学院博士科研启动基金资助项目(NSBSJJ2014020)。

罗雯(1974- )，女，江西南昌人，教授，博士，从事微生物学方面的研究。

2016-06-17

S 144;Q 93

A

0517-6611(2016)24-017-03