特丁基对苯二酚抑制中波紫外线诱发HaCaT细胞氧化损伤

顾炜，马贤德，金连峰，陈家惠

（1.辽宁中医药大学附属医院皮肤科，沈阳 110032；2.辽宁中医药大学教学实验中心生物技术实验室，沈阳 110847；3.辽宁中医药大学附属医院骨科，沈阳 110032；4.沈阳市第七人民医院皮肤科，沈阳 110003）

·论著·

特丁基对苯二酚抑制中波紫外线诱发HaCaT细胞氧化损伤

顾炜1，马贤德2，金连峰3，陈家惠4

（1.辽宁中医药大学附属医院皮肤科，沈阳 110032；2.辽宁中医药大学教学实验中心生物技术实验室，沈阳 110847；3.辽宁中医药大学附属医院骨科，沈阳 110032；4.沈阳市第七人民医院皮肤科，沈阳 110003）

目的观察特丁基对苯二酚（tBHQ）对中波紫外线紫外线B（UVB）诱发人永生化角质形成细胞HaCaT氧化损伤的影响，并探讨其作用机制。方法将HaCaT细胞随机分为4组：正常对照组（G1组）、单纯紫外线辐射组（G2组）、25 μmol/L tBHQ预处理+紫外线辐射组（G3组）、50 μmol/L tBHQ预处理+紫外线辐射组（G4组）。二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯荧光探针法检测细胞活性氧自由基含量；四甲基偶氮唑蓝法检测细胞增殖活性；Western blot检测细胞内及细胞核内核因子E2相关因子2（Nrf2）蛋白表达；应用实时定量PCR检测过氧化氢酶（CAT）和硫氧还蛋白（SRX）的mRNA表达。结果与G1组相比，G2组HaCaT细胞内活性氧自由基含量升高，细胞存活率下降；G3、G4组细胞分别经25和50 μmol/L tBHQ预处理后能明显抑制UVB诱发HaCaT细胞氧化损伤，并存在剂量依赖性。与G2组相比，G3、G4组细胞内及细胞核内的Nrf2蛋白水平显著增加，且细胞内CAT和SRX mRNA表达均明显高于G2组。结论UVB可诱发HaCaT细胞发生氧化损伤；tBHQ可通过增加HaCaT细胞内Nrf2的蛋白表达，并促进其核转位，从而激活Nrf2-抗氧化酶（CAT和SRX）通路，消除活性氧自由基而抑制USB诱发的氧化损伤。

特丁基对苯二酚；中波紫外线；HaCaT细胞；核因子E2相关因子2；氧化损伤

日光中的中波紫外线紫外线B（ultraviolet B，UVB）可以通过诱发其靶细胞表皮中的角质形成细胞氧化应激反应，而导致皮肤出现红斑、炎症、皮肤老化，甚至皮肤癌的发生。特丁基对苯二酚（tert-butylhydroquinone，tBHQ）是一种常见的抗氧化剂，研究表明tBHQ可以通过激活核因子E2相关因子2 （nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）发挥其抗氧化作用，但目前关于tBHQ能否抑制UVB诱发Ha-CaT细胞氧化损伤还未见报道。本研究建立人永生化角质形成细胞HaCaT紫外线辐射模型，观察tBHQ 对UVB辐射导致HaCaT细胞氧化损伤的影响，并探讨其作用机制。

1　材料与方法

1.1材料

人永生化角质形成细胞HaCaT购自上海生博生物医药科技有限公司。日光紫外线模拟器SUV-1000购自上海希格玛高技术有限公司。tBHQ、四甲基偶氮唑蓝、碱性磷酸酶标记的抗兔IgG、抗小鼠IgG、二甲基亚砜，购自美国Sigma公司；二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯荧光素探针、胎牛血清、DMEM、Trizol，购自美国Invitrogen公司；Nrf2、β-actin、Lamin A一抗，购自美国Santa Cruz公司；逆转录试剂盒及PCR扩增试剂盒，购自美国Applied Biosystem公司；核蛋白提取试剂盒，购自碧云天生物技术研究所。

1.2方法

1.2.1细胞培养与实验分组：HaCaT细胞株用高糖DMEM培养基（含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、链霉素），在37℃、5%CO2孵育箱内培养。将细胞随机分为4组：正常对照组（G1组）、单纯紫外线辐射24 h组（G2组）、25 μmol/L tBHQ预处理12 h+紫外线辐射24 h组（G3组）；50 μmol/L tBHQ预处理12 h+紫外线辐射24 h组（G4组），其中G2、G3、G4组的紫外线剂量为60 m J/cm2。

1.2.2二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯荧光探针测定细胞内活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）含量：将各实验组细胞制成单细胞悬液，浓度调整为1×106/mL，加入终浓度10 μmol/L二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯染液，避光，37℃孵育30 min。用荧光酶标仪收集荧光信号（激发波长488 nm，发射波长525 nm）。ROS水平以二氯荧光素荧光强度表示。

1.2.3四甲基偶氮唑蓝法检测细胞增殖活性：细胞分组处理后，每孔加入四甲基偶氮唑蓝20 μL（浓度为5 g/L，用PBS配制），继续避光培养4 h，终止培养，弃上清，加入150 μL的二甲基亚砜，在酶联免疫检测仪上测定波长为490 nm处各孔的吸光度，记录结果。

1.2.4Western blot检测蛋白表达：收集并裂解细胞，超声处理，离心，上清液置于-80℃保存备用。核蛋白使用核蛋白提取试剂盒，按照试剂说明书上的步骤进行提取。SDS-PAGE电泳、转膜并采用特异性抗体进行Western blot分析。一抗：Nrf2（1∶200）、β-actin（1∶1 000）、Lamin A（1∶1 000）；二抗：碱性磷酸酶标记的抗兔IgG（1∶1 000）、抗小鼠IgG （1∶1 000）。采用凝胶成像分析系统分析和计算蛋白的灰度值，以目的条带与内参β-actin、Lamin A的平均灰度值的比值表示蛋白水平，进行半定量分析。

1.2.5实时定量逆转录PCR检测mRNA含量：Trizol法提取细胞总mRNA，按逆转录试剂盒说明书进行RNA逆转录反应合成cDNA。然后以β-actin为内参照进行实时荧光定量PCR。所用引物序列：CAT，5′-TGAGAAGCCTAAGAACGCAATTC-3′和5′-CCC TTCGCAGCCATGTG-3′；SRX，5′-GCTTCCTCTCGG GAGTCCTT-3′和5′-CAGCAACAGCGACTACGAAG TAA-3′；β-actin，5′-TGACCCAGATCATGTTTGG-3′和5′-ATCTCTTGCTCGAAGTCCAG-3′。由PCR曲线得到到达阈值时的循环数（cycle threshold，Ct）值，采用2-△△Ct方法进行相对定量的分析。

1.3统计学分析

2　结果

2.1细胞内ROS含量测定结果

与G1组相比，G2组细胞内ROS含量显著升高（P＜0.05）；与G2组相比，G3、G4组HaCaT细胞内ROS含量明显降低，并呈剂量依赖性（P＜0.05）。见表1。

2.2细胞增殖活性的测定结果

与G1组相比，G2组HaCaT细胞增殖活性明显下降（P＜0.05）；与G2组相比，G3、G4组细胞增殖活性明显提升，并呈剂量依赖性（P＜0.05）。见表1。

2.3Nrf2蛋白表达的测定结果

紫外线辐射24 h后，G2组HaCaT细胞内总的Nrf2以及细胞核内Nrf2蛋白表达明显高于G1组（P＜0.05），G3、G4组细胞内总的Nrf2及核内Nrf2蛋白表达显著增多，与G2组相比差异有统计学意义（P＜0.05），且与tBHQ呈剂量依赖关系。见表1、图1。

2.4 CAT和SRX mRNA的测定结果

与G1组相比，G2组细胞内CAT和SRX mRNA表达增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与G2组相比，G3、G4组CAT和SRX mRNA表达显著提高（P＜0.05），且随着tBHQ剂量的增加，CAT和SRX mRNA也随之增高，呈显著的剂量—效应关系。见表1。

表1 各组间HaCaT细胞内ROS、细胞增殖活性、细胞内总的和细胞核内Nrf2蛋白、CAT和SRX m RNA的表达Tab.1　Determ ination o f ROS，cell viability，whole-ce ll and nuclear Nrf2，m RNA of CAT and SRX in HaCaT cells of different groups

图1　各实验组间HaCaT细胞内和细胞核内Nrf2蛋白的表达Fig.1　Whole-cell and nuc lear Nrf2 protein expressions of HaCaT cells o f different groups

3　讨论

自然界的主要紫外线光源是太阳，根据波长可将紫外线划分为4个波段：紫外线A（波长320～400 nm）、UVB（波长275～320 nm）、紫外线C（波长200～275 nm）、紫外线D（波长为10～200 nm）。其中UVB为中波紫外线，此类紫外线的极大部分被皮肤的表皮层所吸收，表皮中的角质形成细胞是中波紫外线辐射作用的主要靶细胞。近年研究表明［1，2］，中波紫外线辐射可以使角质形成细胞内产生大量ROS，诱发细胞氧化损伤、DNA损伤及细胞凋亡等皮肤损伤，导致皮肤出现红斑、炎症、皮肤老化，严重者可引起皮肤癌，是应重点预防的紫外线波段。

Nrf2是细胞内氧化损伤反应最重要的核转录因子，生理状态下Nrf2与其胞质抑制蛋白Keap1偶联锚定在胞质，当细胞受到氧化应激因子刺激下，Nrf2 从Keap1中解离并转位进入细胞核，与抗氧化反应元件结合，介导其下游抗氧化酶，如SRX、CAT等基因的表达，启动Nrf2-抗氧化酶途径，清除细胞内ROS，降低细胞、组织及器官的氧化损伤［3，4］。tBHQ是一种安全高效的抗氧化剂，根据中华人民共和国食品添加剂使用卫生标准规定，可用于食用油脂、油炸食品、干鱼制品、饼干、方便面、腌制肉制品等。tBHQ是Nrf2的一种激活剂，能通过稳定细胞质内的Nrf2并促进其转位到细胞核而发挥抗氧化作用［5，6］。

本研究结果显示，经UVB辐射后HaCaT细胞内ROS含量明显升高，增殖活性显著受到抑制，说明UVB辐射能产生过量的ROS导致HaCaT细胞氧化损伤。我们用25 μmol/L、50 μmol/L tBHQ预处理后，再经UVB辐射，可见HaCaT细胞内ROS含量较单纯紫外线辐射组明显下降，同时亦减轻UVB辐射对细胞增殖活性的影响，并随tBHQ的剂量增高抑制作用显著增强，说明tBHQ预处理能够通过降低ROS含量，抑制UVB对HaCaT细胞的氧化损伤。为进一步探讨tBHQ抑制UVB对HaCaT细胞的氧化损伤的机制，本研究检测了Nrf2-抗氧化酶途径，结果发现tBHQ预处理可以提高细胞内总的Nrf2的表达，更重要的是Nrf2在细胞核的表达亦随之增加，说明tBHQ可以促进Nrf2核转位。另外，与单纯紫外线辐射组相比，tBHQ预处理能使细胞内的抗氧化酶如CAT和SRX mRNA水平提高，说明tBHQ促进Nrf2核转位后随即激活Nrf2-抗氧化酶途径。

综上所述，UVB可诱发HaCaT细胞发生氧化损伤；tBHQ可通过增加HaCaT细胞内Nrf2的蛋白表达，并促进其核转位，从而激活Nrf2-抗氧化酶（CAT和SRX）通路，降低活性氧自由基水平而抑制USB诱发的氧化损伤。

［1］Salucci S，Burattini S，Curzi D，et al.Antioxidants in the prevention of UVB-induced keratynocyte apoptosis［J］.J Photochem Photobiol B，2014，141（6）：1-9.

［2］Wölfle U，Esser PR，Simon-Haarhaus B，et al.UVB-induced DNA damage，generation of reactive oxygen species，and inflammation are effectively attenuated by the flavonoid luteolin in vitro and in vivo ［J］.Free Radic Biol Med，2011，50（9）：1081-1093.

［3］Zhang DD.Mechanistic studies of the Nrf2-Keap1 signaling pathway ［J］.Drug Metab Rev，2006，38（4）：769-789.

［4］Gęgotek A，Skrzydlewska E.The role of transcription factor Nrf2 in skin cells metabolism［J］.Arch Dermatol Res，2015，307（5）：385-396.

［5］Eftekharzadeh B，Maghsoudi N，Khodagholi F.Stabilization of transcription factor Nrf2 by tBHQ prevents oxidative stress-induced amyloid beta formation in NT2N neurons［J］.Biochimie，2010，92（3）：245-253.

［6］Li J，Johnson D，Calkins M，et al.Stabilization of Nrf2 by tBHQ confers protection against oxidative stress-induced cell death in human neural stem cells［J］.Toxicol Sci，2005，83（2）：313-328.

（编辑陈姜）

Tert-butylhydroquinoneProtectsHaCaTCells from UltravioletB-induced OxidativeDamages

GUWei1，MAXian-de2，JINLian-feng3，CHEN Jia-hui4
（1.DepartmentofDermatology，FirstAffiliated Hospitalof LiaoningUniversityof TraditionalChineseMedicine，Shenyang110032，China；2.Biotechnology Laboratory，ExperimentCenter forTeachingand Learning，LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shenyang110847，China；3.DepartmentofOrthopedics，FirstAffiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China；4.Department of Dermatology，Shenyang No.7 People's Hospital，Shenyang 110003，China）

ObjectiveTo explore the effect of tert-butylhydroquinone（tBHQ）on ultraviolet B（UVB）-induced oxidative damages in human immortalized keratinocytes（HaCaT），and discuss its mechanism.Methods The cultured HaCaT cells were randomly divided into 4 groups：control group（G1），ultravioletirradiation group（G2），25μmol/L tBHQ pretreatmentbeforeultravioletirradiation group（G3），and 50μmol/L tBHQ pretreatmentbeforeultravioletirradiationgroup（G4）.Thecontentof reactiveoxygen specieswasdetected byDCFH-DAmethod，and thecellproliferationwasevaluatedbyMTT.Western blotwasused tomeasure theprotein expression ofnuclear factor E2-related factor2（Nrf2）in both nuclear factions and whole-cell of HaCaT.The mRNA expressions of CAT and SRX were determined by real-time RT-PCR.Results The content of reactive oxygen species in HaCaT cells was increased，and the cell proliferation rate was decreased significantly after ultraviolet irradiation.The pretreatment of 25 and 50 μmol/L tBHQ can inhibit the UVB-induced oxidative damage in a dose-dependent manner in HaCaT cells.Compared with G2 group，tBHQ pretreatment could dose-dependently increase the level of Nrf2 protein in nuclear factions and whole-cell of HaCaT，and also the mRNA expressions of CAT and SRX.ConclusionUVB irradiation can induce oxidative stress damages of HaCaT cells.tBHQ may inhibit the UVB-induced oxidative damages through enhancing Nrf2 expressions and nuclear translocation，then activating the transcription of the downstream antioxidant enzymesCATand SRX.

tert-butylhydroquinone；ultraviolet B；HaCaT cell；nuclear factor E2-related factor 2；oxidative damage

·论著·

R758.1

A

0258-4646（2016）04-0337-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.04.012

辽宁省教育厅科学研究一般项目（L2014363）

顾炜（1976-），女，副主任医师，博士研究生.

金连峰，E-mail：2375792245@qq.com

2015-10-30

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