3α-羟类固醇脱氢酶的亲和纯化及化学修饰提高酶稳定性

方亚男， 段敬霞， 张 玲， 杨海麟

（江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡214122）

3α-羟类固醇脱氢酶的亲和纯化及化学修饰提高酶稳定性

方亚男， 段敬霞， 张 玲， 杨海麟*

（江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡214122）

研究了3α-羟类固醇脱氢酶（3α-HSD）经化学修饰后的稳定性变化。已构建的基因工程菌E.coli BL21（DE3）/pET28a-hsd经诱导表达、镍柱亲和纯化得到电泳纯的3α-HSD酶，酶蛋白得率是16.5%，活性回收率为64.7%，纯化倍数约为3.8，15%SDS-PAGE结果显示3α-HSD酶为单一条带，相对分子质量在28 000左右。采用邻苯二甲酸酐（PA）作为修饰剂，对3α-HSD纯酶进行化学修饰，与对照组相比，修饰酶抵抗pH波动的能力有所增强，50℃水浴10 min后酶的热稳定性明显提高，37℃贮藏40 h后修饰酶的贮藏稳定性比原酶提高9倍。

3α-羟类固醇脱氢酶；亲和纯化；邻苯二甲酸酐；化学修饰；稳定性

3α-羟类固醇脱氢酶 （3α-Hydroxysteroid dehydrogenase，3α-HSD，EC 1.1.1.50），可作用于多种类固醇基质，可逆地催化C19～27类固醇3位羟基/酮基的氧化还原［1］。临床上用3α-HSD作为工具酶来测定人血清中的总胆汁酸 （Total bile acids，TBA）浓度［2］。目前，TBA测定中所用的工具酶3α-HSD均从睾酮丛毛单胞菌中直接提取，但提取过程复杂、酶蛋白得率低，酶的稳定性低，在一定程度上限制了TBA测定的临床推广［3］。因此，要使3α-HSD广泛应用于临床医学中，一方面需要寻求更简单高效的提取纯化方法，另一方面必须要提高3α-HSD酶的催化活性、稳定性。

目前，已有文献报道木瓜蛋白酶、脂肪酶、辣根过氧化物酶（HRP）等多种酶经小分子酸酐修饰后，其催化活性或稳定性得到不同程度的提高［4-7］。邻苯二甲酸酐是赖氨酸Lys的专一修饰剂，PA的羧基能与Lys残基末端的ε-NH2生成酰胺键，能够有效改善酶的性能。

利用重组菌株E.coli BL21（DE3）/pET28a-hsd表达纯化得到融合蛋白，采用邻苯二甲酸酐修饰对3α-HSD的Lys残基进行化学修饰，并对pH稳定性、热稳定性及贮藏稳定性等进行研究，并对修饰效果提出合理的解释。

1 材料与方法

1.1 材料

重组菌株E.coli BL21（DE3）/pET28a-hsd：作者所在实验室保藏。邻苯二甲酸酐购自国药化学试剂有限公司；卡那霉素、异丙基硫代-β-半乳糖苷（IPTG）、咪唑、牛血清蛋白、透析袋：均购自上海生工；所有试剂均是分析纯。

1.2 主要仪器

3 K-15台式高速离心机：SIGMA公司产品；754UV紫外-可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司产品；电热恒温水浴锅：上海医疗器械五厂制造；蛋白电泳仪：美国BIO-RAD公司制造。

1.3 实验方法

1.3.1 融合蛋白 3α-HSD的表达 菌种发酵培养及融合蛋白3α-HSD的诱导表达见文献［3］。离心收集细菌沉淀，超声破碎后离心收集上清液，即获得粗酶液。

1.3.2 融合蛋白3α-HSD的亲和纯化 将Ni-IDA琼脂糖作为亲和介质装柱后，用软管与紫外检测仪相连，先用平衡缓冲液（20 mmol/L，pH 7.5磷酸盐缓冲液）以1 mL/min的流速平衡，将30 mL的粗酶液上样，平衡缓冲液流洗至A280 nm处的吸光值不再变化，用100、200、300、400 mmol/L不同浓度的咪唑进行洗脱，收集有酶活性的洗脱液，脱盐后制样品进行质量分数15%SDS-PAGE电泳分离，检测融合蛋白的纯度［8-9］。

1.3.3 酶活性的测定 按Boyer等人的方法测定酶活性［1］。

1.3.4 蛋白质浓度的测定 采用Bradford法进行蛋白质浓度的测定，以牛血清蛋白为标准蛋白质［10］。

1.3.5 3α-HSD酶的化学修饰 取10 mL，10 mmol/ L预先配制好的邻苯二甲酸酐溶液，与10 mL，1 mg/ mL 3α-HSD酶混合，在4℃下恒温磁力搅拌1 h，反应结束后，将反应液转入预先处理好的透析袋中，在4℃下，用20 mmol/L pH 7.5的磷酸缓冲液透析若干小时，以除去未参加反应的修饰剂［6］。

1.3.6 酶稳定性测定 将修饰酶和原酶分别与不同pH范围6.0～11.0磷酸缓冲液混合，25℃水浴30 min。将修饰酶和原酶分别在25、30、35、40、45、50、55、60℃水浴中保温10 min后测酶活。同时将修饰酶和原酶分别在37℃水浴中放置40 h，每隔一段时间取样，按1.3.3方法测酶活，计算相对残余酶活。以上每个样品的稳定性测定均做3次平行试验取平均值，并计算相对残余酶活［11］。

2 结果与讨论

2.1 融合蛋白3α-HSD的亲和纯化

pET28a作为载体所表达的重组蛋白在其N端有一个6个His组成的“标签”。故利用Ni2+-IDA琼脂糖作为亲和介质，组氨酸与Ni2+之间形成配位相互作用，选择性地将融合蛋白3α-HSD吸附在镍柱上，再用0.1～0.4 mol/L不同浓度咪唑进行洗脱，最终分离纯化出3α-HSD纯酶。

将Ni-IDA琼脂糖作为亲和介质装柱，平衡缓冲液平衡柱床，粗酶液上样后平衡缓冲液流洗至A280处吸光值为定值。用100、200、300、400 mmol/L不同浓度咪唑进行洗脱，蛋白洗脱曲线如图1所示。在0～50 min时间内，大部分杂蛋白没有吸附到亲和层析柱上，其他杂蛋白在51～90 min时间段随着低浓度咪唑的洗脱而被分离出来，而含有酶活的3α-HSD酶在90～104 min内被300 mmol/L浓度的咪唑洗脱下来。

收集3α-HSD纯化过程中的洗脱峰，测定3α-HSD酶活力及蛋白含量，计算比酶活及蛋白回收率，结果如表1所示：亲和纯化后3α-HSD酶蛋白得率是16.5%，活性回收率为64.7%，纯化倍数约为3.8。

取适量粗酶液经镍柱纯化后，将收集到纯酶制备样品，考马斯亮蓝染色后，进行质量分数15% SDS-PAGE凝胶电泳，结果如图2所示。从图中可以看出，300 mmol/L咪唑洗脱下来的3α-HSD为单一条带，相对分子质量在28 000左右，与文献［8］中报道一致。

图1 3α-HSD酶的亲和纯化洗脱曲线Fig.1 Elution curve of affinity purification of 3α-HSD

图2 纯酶的质量分数15%SDS-PAGE分析Fig.2 15%SDS-PAGE analysis of purified 3α-HSD

表1 3α-HSD酶的分离纯化结果Table1 Purification results of 3α-HSD

2.2 原酶与修饰酶的pH稳定性比较

通常，酶分子经过小分子化学修饰后，其耐酸耐碱能力会发生变化。图3显示化学修饰对3α-HSD的pH稳定性影响。与原酶相比较，修饰酶对pH波动表现了更好的抵抗能力。在pH=6和pH=7时，原酶的相对残余酶活低于20%，而在pH 6.0～11.0的范围内，修饰酶的相对残余酶活都大于50%。3α-HSD经邻苯二甲酸酐修饰后pH稳定性得到一定提高。

图3 3α-HSD原酶与修饰酶的pH稳定性比较Fig.3 pH stability comparison of native and PA modified 3α-HSD

2.3 原酶与修饰酶的热稳定性比较

由图4可知，在温度超过45℃时，修饰酶与原酶的相对残余酶活显著的降低。50℃水浴10 min后，原酶的相对残余酶活仅仅15.4%，而修饰酶的相对酶活值高达64.5%。60℃水浴10 min后，原酶完全失活，修饰酶有少量酶活。这与其他研究者报道的结果一致。如刘建忠［6］等人用邻苯二甲酸酐修饰辣根过氧化物酶（HRP）后热稳定性比原酶提高10倍。仝艳军［11］等人曾用EDC活化后的聚赖氨酸修饰肌氨酸氧化酶表面的羧基，能有效的提高该酶的热稳定性。

图4 3α-HSD原酶与修饰酶的热稳定性比较Fig.4 Thermal stability comparison of native and PA modified 3α-HSD

2.4 原酶与修饰酶的贮藏稳定性比较

原酶与修饰酶在37℃水浴中放置40 h，每隔一定时间取样测酶活。由图5可知，随着时间的延长，酶的活性呈下降趋势，但与原酶相比，修饰酶的酶活降低幅度小。当放置40 h时，修饰酶的酶活约是原酶酶活的9倍。

经邻苯二甲酸酐修饰后，3α-HSD的pH稳定性、热稳定性及贮藏稳定性得到不同程度的提高。这种现象可能是：邻苯二甲酸酐与酶表面赖氨酸Lys的氨基反应生成稳定的酰胺键，中和部分3α-HSD酶表面的电荷，使酶在水溶液中的稳定性提高。同时，中和部分电荷也减少酶分子内同种电荷间的排斥，使得酶分子形成更紧密的结构，对酶在酸碱条件下的稳定性有积极作用［12-13］。关于化学修饰提高酶稳定性的原因，也可能是酶分子与修饰剂之间共价连接后，使酶分子结构产生一定的“刚性”，而变得更加有序和致密，从而提高酶的稳定性［14］。

图5 3α-HSD原酶与修饰酶的贮藏稳定性比较Fig.5 Storage stability comparison of native and PA modified 3α-HSD

3 结语

重组菌株发酵培养、诱导表达后，镍柱亲和纯化分离得到3α-HSD纯酶。酶蛋白得率是16.5%，活性回收率为64.7%，纯化倍数约为3.8。采用邻苯二甲酸酐对纯酶进行化学修饰，稳定性试验结果表明，酶的pH稳定性、热稳定性及贮藏稳定性得到不同程度的提高。如修饰酶对pH波动表现了更好的抵抗能力。由此可见，邻苯二甲酸酐修饰是改善3α-HSD酶性质的一种温和、有效的方法。改善的酶学性质对3α-HSD酶在医药，环保等行业的应用有一定的促进作用。

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Affinity Purification of 3α-Hydroxysteriod Dehydrogenase and Enzyme Stability Improvement by Chemical Modification

FANG Yanan， DUAN Jingxia， ZhANG Ling， YANG Hailin*
（Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The stability change of 3α-hydroxysteroid dehydrogenase（3α-HSD）after chemical modification was studied.The purified 3α-HSD was obtained by a induced expression of constructed genetic engineering bacteria E.coli BL21 （DE3）/pET28a-hsd at first and then by an affinity purification using Ni2+-Sepharose column with 16.5%of protein yield，64.5%of recovery yield and 3.8 times of specific activity.The SDS-PAGE （15%，reducing conditions）analysis showed that 3α-HSD was composed of a single polypeptide of～28 kDa.The chemical modification of 3α-HSD was done using phthalic anhydride（PA）.After modification，the pH stability of 3α-HSD increased within pH 6.0～pH 11.0 compared with the control group and its heat stability significantly increased after incubation at 50℃for 10 min.When stored at 37℃for 40 h，the storage stability of modified 3α-HSD was improved about 9-fold than that of native enzyme.

3α-hydroxysteroid dehydrogenase，affinity purification，phthalic anhydride，chemical modification，stability

Q 55

A

1673—1689（2016）07—0747—05

2015-01-08

国家自然科学基金项目 （31301540；21306064）；江苏省科技支撑计划项目 （BE2011625）；江苏省自然科学基金项目（BK2012119）。

杨海麟（1971—），男，江苏无锡人，工学博士，副教授，主要从事发酵工程和酶工程研究。E-mail：673179850@qq.com