Th17、Treg细胞频数在核苷类似物抗HBV过程中的动态变化

余永勤， 李　毅， 陈谭昇， 吕其军， 周　芳

东营市胜利油田中心医院感染病科，东营　257034



·论著·

Th17、Treg细胞频数在核苷类似物抗HBV过程中的动态变化

余永勤， 李毅， 陈谭昇， 吕其军， 周芳

东营市胜利油田中心医院感染病科，东营257034

目的： 探讨辅助性T细胞17(T helper 17 cells, Th17)及调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)细胞频数在核苷类似物治疗慢性乙型肝炎患者过程中的动态变化。方法： 选取30例乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen, HBeAg) 阳性的慢性乙型肝炎患者作为研究对象。所有患者均采用替比夫定治疗。分析所有患者治疗前及治疗第4、8、12、24、36、48周的Treg细胞、Th17细胞频数及Th17/Treg比值。比较治疗前后患者血清总胆红素(total bilirubin in serum,TBIL)、血清直接胆红素(direct bilirubin in serum,DBIL)、丙氨酸氨基转移酶(alanine transaminase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspertate aminotransferase,AST)、乙型肝炎病毒DNA(hepatitis B virus DNA, HBV-DNA)、HBeAg水平，分析Treg、Th17细胞频数与TBIL、DBIL、ALT、AST、HBV-DNA、HBeAg的相关性。结果： 替比夫定治疗后，Treg细胞频数先下降后上升，于治疗第8周时达最低水平；Th17细胞频数呈下降趋势；Th17/Treg比值呈下降趋势，于治疗第24、36、48周时趋于稳定。与治疗前相比，治疗后患者TBIL、DBIL、ALT、AST、HBV-DNA、HBeAg水平均显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)。Treg细胞频数与HBV-DNA、HBeAg水平正相关(P<0.05)；Th17细胞频数与TBIL、DBIL、ALT、AST水平正相关(P<0.05)。结论： 核苷类似物治疗慢性乙型肝炎患者过程中，Treg、Th17细胞频数及Th17/Treg比值呈现动态变化，且与治疗后肝功能指标水平相关，为临床治疗及预后评估提供了依据。

慢性乙型肝炎；替比夫定；Th17细胞；Treg细胞

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)作为非侵袭性嗜肝病毒，其诱导的特异性免疫反应对于控制HBV感染，消除HBV具有重要作用，且HBV诱导宿主产生的一系列特异性免疫细胞、因子均参与肝脏的免疫过程[1-3]。对于乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen, HBeAg) 阳性慢性乙型肝炎患者，适当的免疫反应有利于病情的恢复及转归，而过度的免疫反应是肝功能衰竭的独立危险因素，可进一步恶化预后。

辅助性T细胞17(T helper 17 cells, Th17)和调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)均作为介导核苷类似物抗HBV过程中的CD4+T细胞亚型，分别抑制及促进免疫炎症反应[4-5]。Th17及Treg细胞频数可能在核苷类似物抗HBV过程中存在不同程度的变化[5-6]，而Th17/Treg细胞免疫稳态可作为HBeAg阳性慢性乙型肝炎疗效判断及预后评估的潜在指标。因此，本研究探讨Th17及Treg细胞频数在核苷类似物治疗慢性乙型肝炎患者过程中的动态变化，为后续研究提供参考。

1　资料与方法

1.1一般资料2013年5月-2015年5月，选取在我院治疗的30例HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者作为研究对象。其中男性18例、女性12例；年龄24～51岁，平均(35.5±4.8)岁。纳入标准：(1)HBeAg阳性慢性乙型肝炎初治患者；(2)丙氨酸氨基转移酶(alanine transaminase,ALT)>2倍正常值上限；(3) HBV-DNA>105copies/mL。排除标准：(1)合并其他病毒性肝炎、重型肝炎、肝硬化、肝癌及肾功能不全者；(2)恶性肿瘤和妊娠者；(3)自身免疫性肝病、酒精性肝炎者。本研究通过医院医学伦理委员会审核；所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2治疗方法及观察指标所有患者均采用替比夫定治疗，剂量600 mg/d，持续治疗48周。在治疗前和治疗第4、8、12、24、36、48周时，采集外周静脉血3 mL，分别用于检测Treg、Th17细胞与血清总胆红素(total bilirubin in serum，TBIL)、血清直接胆红素(direct bilirubin in serum，DBIL)、ALT、天冬氨酸氨基转移酶(aspertate aminotransferase,AST)、乙型肝炎病毒DNA(hepatitis B virus DNA，HBV-DNA)、HBeAg水平。1.3Treg细胞的检测取100 μL 静脉血，加入CD4和CD25单克隆抗体，各10 μL，混匀，避光放置20 min；加入2 mL红细胞裂解液，混匀，避光放置20 min；加入2 mL破膜缓冲液，离心，弃上清；加入2.5 μL Foxp3抗体，避光放置2 h。加入1 mL 磷酸盐缓冲液(PBS)，混匀，离心，弃上清。用300 μL在流式细胞仪检测。

1.4Th17细胞的检测取外周静脉血3 mL，加入分离液，离心，分离吸出单个核细胞，0.9%氯化钠液多次洗涤，弃上清液，稀释细胞，于5%CO2温箱培养5 h，分为测定管和对照管；各加入2 mL PBS，离心，弃上清；加入各类型的单克隆抗体，混匀，避光放置20 min；以PBS多次洗涤，于测定管和对照管加入100 μL破膜剂，混匀，避光放置，离心，弃上清；于测定管、对照管加入20 μL 的IL-17A-FITC 20 μL，混匀，避光放置；加入3 mL的PBS，混匀，避光放置，离心，弃上清；加入0.5 mL的PBS，重悬细胞，混匀，避光放置，上机检测。采用全自动生化仪检测血清TBIL、DBIL、ALT、AST水平。1.5肝功能及病毒学指标的检测采用荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)定量核酸分析仪检测HBV-DNA水平；釆用全自动发光免疫分析仪检测HBeAg水平；分析所有患者治疗第4、8、12、24、36、48周的Treg细胞频数、Th17细胞频数及Th17/Treg比值。对比治疗前后的TBIL、DBIL、ALT、AST、HBV-DNA、HBeAg，探讨Treg细胞频数、Th17细胞频数与TBIL、DBIL、ALT、AST、HBV-DNA、HBeAg的相关性。

2 　结　果

2.1治疗期间Treg、Th17细胞频数的变化用替比夫定抗HBV过程中，患者Treg细胞频数呈先下降后上升趋势，于治疗第8周时达最低水平；Th17细胞频数呈下降趋势；Th17/Treg比值呈下降趋势，于治疗24周后趋于稳定(表1)。

2.2治疗前后各项指标的对比结果(表2)表明：核苷类似物治疗48周后，TBIL、DBIL、ALT、AST、HBV-DNA、HBeAg水平均显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1　治疗过程中Treg、Th17细胞频数与Th17/Treg比值的变化　n=30，

表2　治疗前后各项指标的比较　　n=30，

2.3Treg、Th17细胞与临床疗效指标的相关性分析Th17/Treg比值在治疗第4周开始下降，在第12周达最低值(表1)。在治疗第12周时，Treg细胞频数与HBV-DNA、HBeAg水平正相关(P<0.05)，Th17细胞频数与TBIL、DBIL、ALT、AST水平正相关(P<0.05；表3)。

表3　Treg、Th17细胞与临床疗效指标的相关系数　n=30，

*P<0.05

3　讨　论

HBeAg阳性慢性乙型肝炎的损伤性免疫反应中有多种免疫细胞、细胞因子参与，其中Treg/Th17平衡状态被打破是HBV感染发病的关键[6-7]。Th17、Treg细胞均作为CD4+T细胞亚型在HBeAg阳性慢性乙型肝炎中发挥重要的免疫损伤作用。在病情发展的不同阶段，存在不同水平的Th17及Treg细胞频数，Treg/Th17失衡程度也不同。有研究[8]认为，Treg/Th17失衡作为免疫功能紊乱的重要指标，会导致HBV的持续感染，使病情持续发展及恶化。

研究[9]表明，Treg细胞作为导致免疫耐受的主要细胞，可维持机体的免疫耐受和免疫平衡，参与HBeAg阳性慢性乙型肝炎的免疫耐受。Th17细胞作为导致免疫炎症损伤的主要细胞，可分泌多种因子，激发组织炎症，导致肝损伤。有研究[10-11]认为，HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者Treg/Th17失衡，Th17及Treg细胞显著增加，以Treg细胞增加为主。对此，维持Treg/Th17平衡，维持Th17及Treg细胞频数处于合理水平，有利于提高对HBV-DNA、HBeAg的清除率，改善肝功能，促进HBeAg阳性慢性乙型肝炎的转归。

替比夫定作为强效的核苷类似物，广泛用于抗HBV，具有强效抑制HBV复制及HBeAg血清转换率高的特点。本研究中，治疗后TBIL、DBIL、ALT、AST、HBV-DNA、HBeAg水平均显著下降，提示核苷类似物抗HBV的效果确切，可显著改善肝功能、抑制病毒复制及清除病毒。有报道[12-13]指出，核苷类似物抗HBV过程中，快速抑制病毒复制与Treg细胞频数下降密切相关。由于Treg细胞频数与Th17细胞频数负相关，持续性Treg细胞频数下降，可导致Th17细胞频数出现短暂性升高，有利于进一步增强对HBV的消除能力。

本研究显示，HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者采用替比夫定抗HBV过程中， Treg细胞频数呈先下降，后上升趋势，于治疗第8周时达最低水平；Th17细胞频数呈下降趋势；Th17/Treg比值呈下降趋势，于治疗24周后趋于稳定，提示核苷类似物治疗使患者机体免疫状态激活，而病情稳定后机体进入免疫控制状态。TBIL、DBIL、ALT、AST均为肝功能指标。HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者的TBIL、DBIL、ALT、AST水平均高于健康者。HBV-DNA、HBeAg为HBeAg阳性慢性乙型肝炎的预后指标。在核苷类似物抗HBV治疗前后，HBV-DNA、HBeAg水平的差异有统计学意义。本研究中TBIL、DBIL、ALT、AST、HBV-DNA、HBeAg治疗前后的变化与研究[14-15]相似。在本研究中，Treg细胞频数与HBV-DNA、HBeAg水平正相关(P<0.05)，Th17细胞频数与TBIL、DBIL、ALT、AST水平正相关(P<0.05)，进一步提示Treg细胞参与免疫耐受状态，与病情严重程度正相关，而Th17细胞参与免疫损伤过程。

综上所述，核苷类似物抗HBV的效果确切，可显著改善肝功能、抑制病毒复制及清除病毒。Th17/Treg比值作为肝功能监测指标，为慢性乙型肝炎的治疗及预后评估提供了依据。

[1]Chen Y,Fang J,Chen X,et al.Effects of the Treg/Th17 cell balance and their associated cytokines in patients with hepatitis B infection[J].Exp Ther Med,2015,9(2):573-578.

[2]Liang XS,Li CZ,Zhou Y,et al.Changes in circulating Foxp3(+) regulatory T cells and interleukin-17-producing T helper cells during HBV-related acute-on-chronic liver failure[J].World J Gastroenterol,2014,20(26): 8558-8571.

[3]Li J,Shi J,Ren W,et al.Regulatory role of CD4(+)CD25 (+)Foxp3 (+) regulatory T cells on IL-17-secreting T cells in chronic hepatitis B patients[J].Dig Dis Sci,2014,59(7):1475-1483.

[4]Niu YH,Yin DL,Liu HL,et al.Restoring the Treg cell to Th17 cell ratio may alleviate HBV-related acute-on-chronic liver failure[J].World J Gastroenterol,2013,19(26):4146-4154.

[5]Zhang GL,Xie DY,Lin BL,et al.Imbalance of interleukin-17-producing CD4 T cells/regulatory T cells axis occurs in remission stage of patients with hepatitis B virus-related acute-on-chronic liver failure[J].J Gastroenterol Hepatol,2013,28(3):513-521.

[6]Xue-Song L,Cheng-Zhong L,Ying Z,et al.Changes of Treg and Th17 cells balance in the development of acute and chronic hepatitis B virus infection[J].BMC Gastroenterol, 2012, 12:43.

[7]Zhai S,Zhang L,Dang S,et al.The ratio of Th-17 to Treg cells is associated with survival of patients with acute-on-chronic hepatitis B liver failure[J].Viral Immunol,2011,24(4):303-310.

[8]Cheng LS,Liu Y,Jiang W.Restoring homeostasis of CD4+T cells in hepatitis-B-virus-related liver fibrosis[J].World J Gastroenterol,2015,21(38):10721-10731.

[9]Li J,Qiu SJ,She WM,et al.Significance of the balance between regulatory T (Treg) and T helper 17 (Th17) cells during hepatitis B virus related liver fibrosis[J].PLoS One,2012,7(6):e39307.

[10]Li J,Wang FP,She WM,et al.Enhanced high-mobility group box 1 (HMGB1) modulates regulatory T cells (Treg)/T helper 17 (Th17) balance via toll-like receptor (TLR)-4-interleukin (IL)-6 pathway in patients with chronic hepatitis B[J].J Viral Hepat,2014,21(2):129-140.

[11]Su ZJ,Yu XP,Guo RY,et al.Changes in the balance between Treg and Th17 cells in patients with chronic hepatitis B[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2013,76(4):437-444.

[12]Li J,Wu W,Peng G,et al.HBcAg induces interleukin-10 production, inhibiting HBcAg-specific Th17 responses in chronic hepatitis B patients[J].Immunol Cell Biol,2010,88(8):834-841.

[13]Zhang L,Wang Q,Zhao P,et al.Effects of entecavir on peripheral blood lymphocyte profiles in chronic hepatitis B patients with suboptimal responses to adefovir[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2014,41(7):514-523.

[14]Ge J,Wang K,Meng QH,et al.Implication of Th17 and Th1 cells in patients with chronic active hepatitis B[J].J Clin Immunol,2010,30(1):60-67.

[15]Wu W,Li J,Chen F,et al.Circulating Th17 cells frequency is associated with the disease progression in HBV infected patients[J].J Gastroenterol Hepatol,2010,25(4):750-757.

[本文编辑]叶婷， 晓璐

Dynamic change of Th17 and Treg cells frequency in nucleoside analogues anti-HBV treatment

YU Yong-qin, LI Yi, CHEN Tan-sheng, LÜ Qi-jun, ZHOU Fang

Department of Infectious Diseases, Central Hospital of Dongying Shengli Oil Field, Dongying 257034, Shandong, China

Objective： To investigate dynamic change of T helper 17 cells (Th17) and regulatory T cells(Treg) frequency in hepatitis B e antigen(HBeAg) positive chronic hepatitis B patients receiving nucleoside analogues treatment. Methods： A total of 30 chronic hepatitis B patients with positive HBeAg were enrolled. All the patients received telbivudine antiviral treatment. The peripheral blood Treg cell frequency, Th17 cell frequency and Th17/Treg ratio were detected before treatment and at 4th, 8th, 12th, 24th, 36th, 48thweeks after treatment. The total bilirubin in serum (TBIL), direct bilirubin in serum (DBIL), alanine transaminase (ALT), aspertate aminotransferase (AST), hepatitis B virus DNA (HBV-DNA) and HBeAg level were detected and compared between before and after treatment. The correlations of Treg cell frequency and Th17 cell frequency with the indexes of TBIL, DBIL, ALT, AST, HBV-DNA, HBeAg were analyzed, respectively. Results： Treg cell frequency was decreased then increased and reached the minimum point at 8thweeks after treatment. Th17 cell frequency decreased during treatment; and Th17/Treg ratio decreased and was stable at 24th, 36th, 48thweek after treatment. The levels of TBIL, DBIL, ALT, AST, HBV-DNA and HBeAg were significantly decreased after treatment (P<0.05). Treg cell frequency was positively correlated with HBV-DNA and HBeAg levels (P<0.05). Th17 cell frequency was positively correlated with TBIL, DBIL, ALT and AST levels (P<0.05). Conclusions： Treg cell frequency, Th17 cell frequency and Th17/Treg ratio shows dynamic changes during nucleoside analogues treatment for HBeAg positive chronic hepatitis B patients. They are correlated with liver function indexes after treatment; they can provide evidence for clinical treatment and prognosis evaluation.

chronic hepatitis B; telbivudine; Th17 cell; Treg cell

2016-01-13[接受日期]2016-04-08

余永勤,主任医师.E-mail: yuyong_qin@sina.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160286

R 512.6

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