正交试验优选褐藻糖胶的提取工艺

何　丹，张　旭，陈柳君，胡晨熙，沈　莹，倪伶俐，吴明江

（温州大学生命与环境科学学院，浙江温州　325035）

正交试验优选褐藻糖胶的提取工艺

何丹，张旭，陈柳君，胡晨熙，沈莹，倪伶俐，吴明江

（温州大学生命与环境科学学院，浙江温州325035）

采用正交试验法优选羊栖菜褐藻糖胶的提取工艺，以褐藻糖胶的收率为考察指标，研究提取温度、酸浓度和提取时间对其产生的影响。结果表明影响收率因素依次为：提取温度＞酸浓度＞提取时间，优选提取工艺为提取温度为50℃，酸浓度为2 mol/L，提取时间为3 h。并且对样品进行了理化性质的分析，包括单糖组成、分子量和红外图谱。该方法操作简便，得到分子量范围为7 100～133 800 Da的褐藻糖胶，收率最高为8.9%，单糖组成稳定，硫酸根含量高。

正交试验；羊栖菜；褐藻糖胶；提取工艺

羊栖菜Sargassum fusiforme是历史悠久、分布广泛、产量高的大型海藻；它具有较高的食用价值和药用价值［1］。褐藻糖胶是一种含有硫酸根的水溶性多聚糖，具有广谱的生物活性，如抗氧化、免疫调节、病原体抑制剂、抗肿瘤、抗炎、抗血栓等，引起许多学者的深入研究［2-3］。已报道对于褐藻糖胶的提取方法有很多，包括水提法、酸提法、酶解法、超声波提取法等［4］，但是其中方法相对简便、成本较低的是水提法和酸提法，然而水提法得率较低，产物杂质多，增加了分离纯化步骤难度；酸提法会对褐藻糖胶的结构产生影响。已有文献报道羊栖菜褐藻糖胶的提取率为3.78%，岩藻糖为5.69%，总糖含量33.92%，硫酸根15.86%，忽略了样品理化性质的鉴定［12］。为了提高褐藻糖胶得率，保留硫酸根等活性基团，本实验通过提取温度、酸浓度和提取时间设计正交试验优选盐酸法提取羊栖菜褐藻糖胶的条件，并且同时对所有样品的理化性质进行了分析，包括单糖组成、分子量、硫酸根含量和样品的基础结构。本实验为褐藻糖胶的进一步分离纯化、活性研究奠定基础，也为相关羊栖菜高端产品的开发提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料

羊栖菜：浙江省洞头县羊栖菜养殖地提供。

D-葡萄糖醛酸，sigma；右旋糖酐标样，D-甘露糖，D-木糖，中国药品生物制品鉴定所；L-鼠李糖，D-半乳糖醛酸，国药集团化学试剂有限公司；D-葡萄糖，TCI；D-半乳糖，L-阿拉伯糖，Dr.Ehrenstorfer GmbH；L-岩藻糖，FlukaBioChemika等。

1.2仪器

1525高效液相色谱仪，Waters科技有限公司；TENSOR27红外光谱仪，Bruker光谱仪器公司；Milli-Q超纯水仪，MILLIPORE公司；ODS-2HYPERSIL色谱柱，Thermo Scienfic；TSK gel G-3000PWXL-CP色谱柱，日本TOSOH公司；SCANVAC真空低温冷冻干燥机，Labogene ApS等。

1.3实验方法

1.3.1羊栖菜褐藻糖胶的提取工艺

选取干燥的羊栖菜粉碎成粉，按照羊栖菜藻粉（m）：95%乙醇（v）=1：5的料液比回流脱脂，得到脱脂藻粉。按照脱脂藻粉（m）：盐酸（v）=1：30的料液比，得到羊栖菜粗多糖溶液，用氢氧化钠中和，浓缩，加入适量4 mol/L氯化钙沉淀褐藻胶，离心，上清液经3 000 Da透析袋透析，浓缩，按照浓缩液（v）：95%乙醇（v）=1：4的比例加入乙醇，搅拌混匀，4℃放置12 h，离心，收集沉淀并复溶于蒸馏水中，低温减压干燥，得到羊栖菜褐藻糖胶，因素-水平表见表1所示。

表1　正交试验因素水平表Tab.1　Factor and levels for orthogonal array design

1.3.2单糖组成分析

应用PMP衍生化及高效液相色谱法测定其组成和含量［5］。样品加入2 mol/L三氟乙酸120℃水解1 h。标准对照品（其中包括葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸）水解样品经PMP衍生化后进行HPLC分析，利用Thermo Hypersil ODS-2色谱柱（4.6×250mm）和Waters HPLC系统（1525泵，2487双波长紫外可见检测器，717自动进样器）进行测定，流动相PBS：乙腈=83：17，流速为0.8 mL/min，进样量为20 μL，检测波长为254 nm。

1.3.3分子量测定

应用高效凝胶渗透色谱法测定其分子量［6］。标准对照品为右旋糖苷（其中分子量分别是180、7 100、21 400、41 100、133 800、2 000 000 Da）。利用TSK gel G-3000PWXL-CP色谱柱 （7.8×300mm）和Waters HPLC系统（1525泵，2414示差折光检测器，717自动进样器）进行测定，流动相为0.1 mol/L硫酸钠溶液，流速为0.6 mL/min，进样量为20 μL。

1.3.4红外光谱分析

应用FT-IR法分析多糖的基础结构［7］。取少量干燥样品，加入适量KBr粉末在红外干燥箱中充分研磨，压片，在4000～500cm-1范围内进行红外扫描。

1.3.5总糖含量测定

应用苯酚硫酸法测定总糖含量［8］。以L-Fuc为标准品制作标准曲线，多糖样品溶液浓度为0.1 g/L进行测定。

1.3.6硫酸根含量测定

应用离子色谱法进行硫酸根含量测定［9］。用1 mol/L盐酸100℃水解3 h，氢氧化钠中和后，选用Shodex IC-52 4E柱（4.0×250mm），以4.5 mmol/L碳酸钠和0.8 mmol/L碳酸氢钠为流动相，流速为0.8 mL/min。

2　结果分析

2.1正交试验结果分析

由表2中正交试验方差分析结果可知，极差的结果为RX＞RY＞RZ，影响羊栖菜褐藻糖胶提取率的影响大小为提取温度（X）＞酸浓度（Y）＞提取时间（Z），由此得出最佳提取工艺为X2Y3Z3，即提取温度为50℃，酸浓度为2 mol/L，提取时间为3 h。由表3结果表明：提取温度，酸浓度，提取时间对以盐酸为介质的褐藻糖胶提取收率无显著影响。

表2　正交试验设计表及结果Tab.2　Design and result of orthogonal test

表3　方差分析表Tab.3　Analysis of variance table

2.2总糖含量和硫酸根含量结果分析

由表4结果可知：9组样品的总糖含量相近（除I样品偏低），但A-F样品硫酸根含量相近，G-I样品硫酸根含量低，说明硫酸根在25℃和50℃的提取温度下未受影响，然而在100℃的条件下硫酸根含量大幅度降低，说明在高温下，硫酸根会被大量水解，提取硫酸化多糖时温度不能过高。

表4　样品的总糖含量和硫酸根含量Tab.4 Total sugar content and sulfate content of the sample

2.3单糖结果分析

对样品单糖分析的结果见表5，以标准品为参照，根据保留时间判定样品中都是由L-Fuc、D-Glc、DGal、GulA、D-Man、ManA、Rha、GlcA这8种单糖组成，GulA和ManA是根据已报道的文献判定［10］。其中AF样品中单糖比例相接近，主要由L-Fuc、D-Glc和D-Gal组成，属于典型的褐藻糖胶，而G和H样品主要由GulA和ManA组成；I样品主要由GulA、ManA、L-Fuc组成。A～F组单糖比例相接近，G-I样品与A-F样品比较，L-Fuc、D-Gal等中性糖比例相差很大，由于100℃时温度过高，中性糖被大量水解，但组成单糖种类不变。

2.4分子量分析结果

如图1相对分子质量分布色谱图所示，9个组合中，A-F样品的相对分子量在7 100～138 800 Da范围内，G-I样品的相对分子量在180～7 100 Da范围内。从图中可知A-F这6个样品，分子量在25℃和50℃中影响不大，然而在100℃时，色谱峰整体向右移，大分子多糖被大量水解，从G-I样品图中可知，在100℃时，色谱峰面积随着酸浓度增加而变小，逐渐水解为小分子量多糖。

表5　样品的单糖组成Tab.5　The monosaccharide composition of the sample

图1　样品的分子量Fig.1 The molecular weight of the sample

2.5红外分析结果

将得到9个组合的样品进行红外图谱扫描，结果如图2所示，图谱中在3 410～3 440cm-1处都有强的-OH键的伸缩振动，该处为多糖类物质的特征吸收；在2 920～2 930cm-1和2 852cm-1处有C-H的伸缩振动；在1 600～1 630cm-1附近有羰基非对称伸缩振动、酰胺基N-H变角振动；在1 430cm-1附近的吸收为糖类中CH变角振动；在1 030～1 050cm-1处为吡喃环中C-O-C伸缩振动；在1 250cm-1处有硫酸根的S=O的对称伸缩振动，样品A、B、E在830cm-1处吸收较弱，其中E样品为C-O-S的伸缩振动（轴向配位）而样品C、D、F在830cm-1处吸收较强，这一处是α-糖苷键的特征吸收，也是C-O-S的振动位置，碳架构型可能是α-吡喃糖；样品G、H、I在880cm-1附近有较弱吸收峰，该处是β-糖苷键的特征吸收，碳架构型可能是β-D-吡喃糖；样品G、H都在815cm-1附近有较弱的吸收为C-O-S的伸缩振动（赤道配位），是在580～620cm-1处有显著的O-S-O非对称变形吸收。证实A-I样品中A-F样品都含有大量的硫酸根，而G～I样品有较少的硫酸根。

图2　样品的红外光谱分析Fig.2　The infrared spectrum analysis of the sample

3　结论

试验结果表明，以盐酸为介质提取羊栖菜褐藻糖胶的工艺中，影响收率因素依次为：提取温度＞酸浓度＞提取时间。综合上述结果表明优选提取工艺为提取温度为50℃，酸浓度为2 mol/L，提取时间为3 h。根据已报道的提取率比较［11-12］，本文筛选的提取工艺得到的褐藻糖胶提取率较高；提取的褐藻糖胶硫酸根含量高，已有文献报道硫酸根含量高的多糖活性较好［13-14］。此方法提取的褐藻糖胶主要由L-Fuc，D-Glc和D-Gal组成，分子量在7 100～138 800 Da范围内的杂多糖，进一步推测我们得到褐藻糖胶的生物活性较好；该方法操作简便，成本较低，是一种比较理想的提取方法。

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Orthogonal Array Design Method of Optimization of Fucoidan Extraction Process

HE Dan，ZHANG Xu，CHEN Liu-jun，et al
（College of Life and Environmental Science，Wenzhou University，Wenzhou325035，China）

The effect of extraction temperature，time and concentration of acid on the yield of fucoidan from Sargassum fusiform was investigated using orthogonal experiment design.The result showed the influence by the parameters decreased in the order of：extraction temperature＞concentration of acid＞extraction time.The optimum conditions of extraction were determined as follows：extraction temperature 50℃，acid concentration 2 mol/L，extraction time 3 hours.And the sample has carried on the analysis of the physical and chemical properties，including the monosaccharide composition，molecular weight，infrared spectrum.This process was convenient and high in yield（8.9%）.The product had the typical characteristics of fucoidan with the molecular weight range from 7 100 Da to 133 800 Da，stable monosaccharide composition and high sulfate content.

orthogonal array design；Sargassum fusiforme；fucoidan；extraction

R284

A

1008-830X（2016）02-0122-05

2015-12-10

国家自然科学基金（31470430；31200266）

何丹（1990-），女，黑龙江齐齐哈尔人，硕士研究生，研究方向：糖生物学.

吴明江，男，教授，研究方向：糖生物学.Tel：0577-86689078；E-mail：wmj@wzu.edu.cn