糖尿病动物模型复制方法研究概况

付黎明　李铁　吕佳　王之虹

[摘要]糖尿病主要是以高血糖为特征的代谢性疾病，其对人体的危害仅次于癌症。不同类型糖尿病发病机理各不相同，制作糖尿病动物模型的方法也不相同，常用的方法仍然为化学药物诱导法。随着科学技术的发展，基因敲除型，自发性动物模型等实验方法也逐渐应用。各种制作方法的优势及怎样制备，了解不同动物模型的特点并应用研究，对临床上如何更好的治疗糖尿病患者意义重大。

[关键词]糖尿病；动物模型；研究概况；综述

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]2095-0616（2016）03-41-05

仅用空腹血糖指标作为新的糖尿病诊断标准是1997年美国糖尿病学会（ADA）建议提出的，即FPG<6.1mmol/L为正常人群[正常空腹血糖（NFG）]，6.1mmol/L≤FPG<7.0mmol/L为空腹血糖升高（IFG），FPG≥7.0mmol/L为糖尿病人群（DM）。它是一种代谢性疾病，临床有1型、2型、特异性和妊娠糖尿病之分。青少年与儿童若发生糖尿病多为1型糖尿病。多以起病急，“三多一少”，乏力消瘦为特征。因为此类糖尿病的发病机制为体内胰岛素含量不足，所以需要用胰岛素控制病情。而2型糖尿病多在中年发病，大多35岁以上，此类人体内胰岛素含量正常，但功能弱，治疗时可以利用药物刺激其分泌，但部分人仍需要胰岛素治疗。建立糖尿病模型，旨在更好的进行糖尿病及其相关疾病的研究。在实验室中如何做出糖尿病动物模型，现就各型糖尿病如何制作动物模型作以下总结。

1.手术切除胰腺法

1889年Minkowshi在手术切术大狗胰腺以后，首次制作出了多饮多食多尿及尿糖的糖尿病大狗。Kurup等也切除了BALB/c小鼠的部分胰腺，同样诱导出类似2型糖尿病动物模型。袁晖等在1998年制作糖尿病犬模型时，手术切除大狗全部胰腺，在术后3d连续监测血糖，造模成功，血糖超过11.1mmol/L。但此种制作方法，注射量较大，死亡率较高，不能够真实的模拟糖尿病血糖情况。

2.化学药物诱导法

2.1四氧嘧啶法（Alloxan）

Alloxan为一种胰岛β细胞毒剂，可以使其坏死，不能正常分泌胰岛素。通过产生H₂O₂等超氧自由基选择性地破坏胰岛β细胞，辅酶I含量下降，两者使得胰岛素减少发生在β细胞合成之前，最终导致血糖过高和糖尿病发生。

代小思在2011年设计实验选取健康150只SD大鼠，分别四种不同剂量经腹膜腔注射四氧嘧啶。24h后测血糖，结果显示剂量为150～160mg/kg四氧嘧啶的一组造模成。

但利用此种方法造模会造成很严重的肝肾损伤，随着剂量增加，所引起的糖尿病越严重，与糖尿病发病机制不同。近年很少应用。

2.2链脲佐菌素法（STZ）

STZ是一种使动物的胰岛β细胞产生毒性的广谱抗菌素，高剂量致β细胞坏死，STZ含亚硝酸基化合物，能特异性破坏胰岛β的氧化侵袭，胰腺不能分泌相匹配的胰岛素进行抵抗，使机体不能耐受糖分而出现糖尿病。此种氧化侵袭与人体1型糖尿病发病相似；高热量饮食，再配合低剂量STZ，胰岛素作用于外周组织时作用减低，即可诱导出与2型糖尿病接近的动物模型。

于海英等在2011年设计实验组对30只大鼠进行STZ溶液腹腔注射，剂量为55mg/kg，而后在第9天时显示造模成功，空腹血糖>16.65mmol/L。STZ诱导糖尿时，存在剂量不同，制作的动物模型往往差异性很大。查阅文献中有一次腹腔给药45mg/kg、65mg/kg、90mg/kg、200mg/kg等的研究，基本上一次性大剂量注射STZ，建立的大鼠模型类似于1型糖尿病。利用此种注射STZ诱导的动物模型，能够破坏哺乳动物的胰岛β细胞，这种造模方式类似1型糖尿病的造模方式。但不同于2型糖尿病的发病机理，这点有待提高。

张琴等在2004年设计用饮食失节法配合STZ联合用药，STZ的用量为50mg/kg，并且是一次性的腹腔注射。并配合不规则饲养并配合高热量饲料，72h后血糖持续大于16.7mmol/L，表明了造模成功。王保伟等高脂饲料喂养大鼠4周后，腹腔注射STZ 30mg/kg造模成功。利用小剂量并且分次给药STZ的方法能够做出类似2型糖尿病的动物模型，可以有效的模拟糖尿病的发病机理，并且动物死亡率相对减少，是研究2型糖尿病的发病机理理想动物模型。

桂莉等在2010年设计实验室中对SD雄性大鼠以高脂高胆固醇喂养配合STZ联合用药，以高脂高醇食物灌胃加糖水喂养，2个月后加小剂量链脲佐菌素20mg/kg分两次给药，可以建成糖尿病大鼠模型，并且成活率>90%，且有较好的稳定性。特殊膳食诱导的糖尿病模型由Houssay和Martinez在1947年首先报道。张松筠等在实验中把50只SD大鼠高脂饮食但仅24只被纳入食源性肥胖组，并且成模率高达100%，说明此种方法可以制作出糖尿病动物模型。但实验中50只大鼠仅有24只被纳入食源性肥胖组，其余小鼠体重均保持正常。此种方法在实验中大鼠选择上，比较浪费，但只要符合食源性肥胖组的大鼠，造模成功率又相当高，此种方法造模要求较高，难度较大。

2.3四氧嘧啶与链脲佐菌素联合用药

Alloxan与STZ两种药物均是一种β细胞毒剂，通过使大鼠胰岛β细胞损伤而建立起大鼠模型。目前临床常用的糖尿病动物模型制备方法为这两种药物诱导动物。但二者单独使用时毒副作用都很强，不利于制作出类似人类病理机制的模型，并且模型成功率较低。STZ较之于Alloxan实验中更为常用，优点为成模快，较稳定，种属选择性不强，组织毒性相对较小等优点。刘晟等在2008年时实验中利用四氧嘧啶与链脲佐菌素联合用药实验中6只雄性狗，其中五只出现高血糖现象，平均达（22.7±3.2）mmol/L，胰岛素用量从2U/d增至（21.4±2.4）U/d。但有3只雌性狗死亡。两种药物联合用药的好处在于用药小，对动物的肝肾损伤小，但雌性狗不耐受出现死亡。需要注意的是在给药后在特定时间内为了防止低血糖或者预防成模后的高血糖，需要及时给与一定剂量的葡萄糖。

3.自发性糖尿病动物模型

1975年由Goto等在白化的Wistar大鼠中选出血糖较高的大鼠进行培养即GK大鼠，它具有血糖轻度升高，胰岛素分泌能力低，胰腺β细胞团块量减少等特点。胡泊洋等在实验中从第13周龄起连续监测GK大鼠的基础血糖值、体重、摄食量和饮水量。饲养到24～32周时，大鼠表现出了明显的糖尿病特征，且大鼠的死亡率很低。胰岛素分泌不足和细胞凋亡是导致高血糖和代谢性需求不足的主要原因。但这种大鼠虽然能很好的模拟人类发病机制，但模型很难建立，需要很长的造模时间，并且成活率较低，造模难度大，实验研究中受到局限。

Zucker肥胖大鼠的“肥胖基因”（fa）的是1961年Zucker兄弟发现的，fa基因缺陷的纯合子个体（fa/fa），具有肥胖、高糖皮质激素、高血压糖耐量减低等特点。在2型糖尿病动物研究中常用Zucker肥胖大鼠。

NSY小鼠是从Jcl-ICR小鼠亲株近交系小鼠，选择葡萄糖耐量低的小鼠进行繁殖。它具有年龄依赖性自发性糖尿病特点。但造模时间久，胰岛素的抵抗在12周龄时仍不明显。如控制饮食则病情发展更慢，高脂食品能够加速疾病的发生过程。

OLETF大鼠是1984年日本一家制药公司杂交出来的自发性2型糖尿病大鼠。其胆囊收缩素（CCK）-A受体mRNA的表达完全缺失，其中ODBl和ODB2基因、睾酮与其发病相关。但此大鼠虽然模拟了人类的发病过程，但成活率不高，制作模型时间长，经费高等都需要改进。

1994年ob/ob小鼠中ob基因突变被证实且为纯合子。是一种因obese基因纯合子突变，不能表达正常功能的蛋白质，在4周时会出现体重增加变快，肌肉和肝脏均存在多种胰岛素信号通路传导系统的损害。C57BL/KsJ品系小鼠的瘦素受体基因（dh）在1996年被Jackson发现的，此基因呈隐性遗传，位于4号染色体上。ob/ob小鼠、db/db小鼠均属遗传性肥胖T2DM动物模型，基因也成隐性遗传，其发病均与瘦素基因有关，小鼠出现三多一少的症状，此种方法用于研究2型糖尿病血脂紊乱的研究和多种抗糖尿病药物的筛选。此类动物对环境变化敏感，饲养条件苛刻，需要经费较大。

Kondo等于1957年报道了Kkay小鼠能自发出现明显肥胖、血糖高和高胰岛素血症，Kkay小鼠是在KK小鼠转入突变毛色基因（ay）形成的。其ay基因可以影响小鼠毛色与代谢紊乱，并出现肥胖高血糖等症状，雄性小鼠症状更明显。Kkay小鼠的表达人类2型糖尿病类似。属于自发性2型糖尿病动物模型，是研究早期肾脏损害的2型糖尿病的理想动物。但模型的制备难度较大，需要经费也较高。

1978年将雄性IIM大鼠系繁殖，产出了糖尿病系eSS大鼠。此种大鼠为不伴肥胖的早发糖耐量受损且随增龄而加重，并发展为严重的高血糖。1975年培养BHE系亲代的一个亚系即为Bhe/Cdb大鼠，表现为空腹高血糖和高脂血症。

BB大鼠是自发性的CD8+与CD4+T淋巴细胞减少，带有甘氨酸水解酶活性的核苷酸辅酶I的T细胞表达ART2。可以作为胰岛素耐受诱导的糖尿病动物理想模型。中国仓鼠是通过选择糖耐量异常的个体，近交繁殖而得，具有血糖高，而非肥胖的特性。属于自发性遗传性l型糖尿病的动物模型。

CD（Cohen diabetic）大鼠，利用糖尿病敏感型大鼠进行试验对比，普通喂养不表现糖尿病症状，而给予高糖低铜致糖尿病饮食时，则大鼠表现出糖尿病症状，而抵抗型大鼠仍然保持正常血糖。其营养代谢环境、遗传背景中的关系可以进步一研究，它为一种特殊的遗传衍生的糖尿病动物模型。

自发性糖尿病动物模型目前都是针对于2型糖尿病的研究，以后各型糖尿病如何制作自发性糖尿病动物模型有待研究。

4.基因敲除法动物模型

单基因敲除，小鼠的外周胰岛素抵抗受到Glut-4的一个等位基因敲除的影响，但肝的胰岛素没受影响，说明改变了体内的糖平衡。人与动物都易出现脂肪肝、糖尿病性心肌病。与2型糖尿病患者相似，此种小鼠不肥胖，可以作为此类的2型糖尿病动物模型。

多基因敲除法，即指两种动物分别基因敲除，而后进行杂交。GK+/-小鼠，其胰岛素分泌变少，出现耐糖量的异常，而IRS-1-/-小鼠的胰岛素抵抗被β细胞的增生抵消了。杂交的后代表现出胰岛素功能异常而出现糖尿病。

NSY（Nagoya-Shibata-Yasuda）小鼠，根据葡萄糖耐量选择性的对Jcl：ICR小鼠近交繁殖而成。其糖尿病发病模式具有性别差异性，雄性几乎全部发展为糖尿病，雌性发病率仅为30%。NSY小鼠还具有年龄的依赖性，适用于糖尿病动物模型。

5.肾上腺素性糖尿病动物模型

王金海在2011年利用生理盐水配置成0.8%的肾上腺素溶液，腹腔注射2U/10g，取小鼠眶静脉采血并测血糖，肝糖原的多少用葱酮法检测，肾上腺素配置成0.8%的溶液，成功制作出肾上腺素性糖尿病模型。

6.T细胞介导诱导糖尿病模型

邹晓蕾等在2006年选用BALB/c小鼠并给予多次小剂量的STZ喂养，并建立T淋巴细胞系，利用处死后的脾细胞悬液制作并放入小鼠体内。结果显示3×10³T或1.5×10⁶T细胞过与2次STZ喂养，或加用2次环磷酞胺即能制备1型糖尿病动物模型。尚无对于2型糖尿病模型的研究文献。

7.结论

综上所述可以看出1型、2型糖尿病发病机理，好发年龄等都有所不同。糖尿病发病源于胰岛素不能很好发挥作用，使机体糖量不能及时分解。有研究认为胰岛细胞凋亡是导致糖尿病发病的原因，但实验中如何制备出更符合1型与2型糖尿病的模型仍需进一步研究。目前实验中常用药物制备模型方法制备，但这样往往伤害动物肝肾功能，与人类发病机理不同。而自发性糖尿病模型与高糖高胆固醇方法制备模型，模型成模率低，动物容易死亡，所用经费较高。仍需进一步改善。研究者需针对其发病机理，及针对β细胞的方面进行研究，制作出更符合1型与2型糖尿病的模型。对于选择哪种造模方式进行造模，应根据具体的实验的研究目的、实验条件及经费等情况具体问题具体分析。每种类型的造模方式都具有其优势及局限性。如果在动物模型中更好的模拟出人类发病的机理及过程，如何减少动物肝肾损伤，如何增加成模率，如何缩减成本及减少造模时间等，将更有利于人类糖尿病的治疗与技术的提高。随着生物技术的发展，将开发出更多更好的动物模型，为人类糖尿病研究做出贡献。