免疫磁珠分选法原代培养小鼠肺微血管内皮细胞

周玲萍，冯成，汤雪斌，徐红蕾

（温州医科大学附属第一医院 呼吸与危重症医学科，浙江 温州 325015）



免疫磁珠分选法原代培养小鼠肺微血管内皮细胞

周玲萍，冯成，汤雪斌，徐红蕾

（温州医科大学附属第一医院 呼吸与危重症医学科，浙江 温州 325015）

目的：探讨一种高效、稳定的小鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）原代培养方法。方法：选取45 只1周龄Balb/c小鼠，随机分成3组，分别用酶消化法、组织贴块法、免疫磁珠分选法3种方法分离培养小鼠PMVECs，观察细胞形态学以及VI I I因子相关抗原免疫荧光染色鉴定内皮细胞，计算各组原代培养成功率及从原代培养开始到首次传代所需时间，测定细胞纯度，MTT法绘制生长曲线。结果：3组原代培养的细胞在倒置显微镜下均能见到短梭形、多边形的微血管内皮细胞，血管内皮细胞特异性标志物VI I I因子相关抗原表达阳性。免疫磁珠分选法组原代培养成功率及细胞活性显著高于其他2组，差异有统计学意义（P＜0.01），从原代培养至首次传代所需的时间短于组织贴块法组，差异有统计学意义（P＜0.05），细胞纯度显著高于酶消化法组，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：相比于酶消化法与组织贴块法，免疫磁珠分选法原代培养小鼠PMVECs具有重复性好，分离速度快，细胞纯度高及活性好的优点。

细胞培养；原代培养；免疫磁珠；肺微血管内皮细胞

建立高效的肺微血管内皮细胞（pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs）体外培养方法对急性肺损伤等疾病发病机制及药物治疗等方面的研究起着重要作用。目前文献报道体外培养PMVECs的方法主要有酶消化法、组织块培养法、免疫磁珠分选法，但由于PMVECs较脆弱难成活、生长缓慢、易污染、不易纯化等原因，目前其培养仍是一个难题。本研究对上述3种PMVECs体外培养方法进行比较，明确不同培养方法的优缺点，探讨出一种稳定的PMVECs培养方法。

1　材料和方法

1.1材料 健康1周龄Balb/c小鼠45只，雌雄不限，由温州医科大学实验动物中心提供。EndothelialCell Medium（Sciencell公司），FBS（Gibco公司），0.25%胰蛋白酶（Gibco公司），I型胶原酶（Gibco公司），大鼠抗小鼠CD31单克隆抗体（Invitrogen公司），羊抗大鼠IgG磁珠（New England公司），兔抗人VI I I因子相关抗原多克隆抗体（Santa公司），IV型胶原酶（Gibco公司），中性蛋白酶（Roche公司），MTT（Sigma公司）。

1.2方法

1.2.1分组与肺组织的分离：取Balb/c小鼠45只，随机分为酶消化法组、组织贴块法组、免疫磁珠分选法组，每组各15只。用10%水合氯醛（0.35 mL/ 100 g）麻醉后置75%乙醇浸泡消毒3 min。将小鼠置无菌操作盘上，用无菌眼科剪、眼科镊逐层打开胸腔暴露心肺，自右心室心尖处进针缓慢推注10 mL DMEM液（含肝素与双抗），直至肺组织发白。剪取小鼠心肺组织置DMEM液中，移入超净台内备用。

1.2.2细胞原代培养：酶消化法［2］：超净台内剪取肺组织，加入0.25%胰蛋白酶5 mL消化5 min。将周缘肺组织剪碎成尽可能小的组织块。将组织块吸入离心管中，加入3 mL IV型胶原酶（2.25 mg/mL），培养箱消化10 min。再加入3 mL中性蛋白酶（10 mg/mL）消化15 min，期间每5 min振荡1次。置离心机上1 000 r/min离心5 min，弃上清，用10 mL DMEM（含10% FBS）重悬成细胞悬液。200目细胞筛网过滤后制备单细胞悬液，离心后弃上清。加入3 mL ECM重悬后接种到1%明胶包被的6孔板中，置培养箱培养。2 h后换液除去未贴壁及坏死细胞继续培养，此后每2 d换液1次。②组织贴块法［3］：在超净台内剪取肺组织，加入0.25%胰蛋白酶5 mL消化5 min。周缘肺组织剪成1×1×1 mm3大小组织块，均匀铺在盛有500 μL FBS的35 mm培养皿中，置培养箱内孵育。45 min后将组织块取出并均匀贴入1%明胶包被的6孔板中，斜置培养箱中固化1 h。加入500 μL ECM培养基，平置培养箱继续培养。24 h后追加500 μL ECM培养基，60 h后将组织块去除并换液，此后每2 d换液1次。③免疫磁珠分选法［4］：CD31抗体磁珠配制：超净台内取20 μL羊抗兔IgG磁珠，加入预冷的DMEM（含10% FBS）1 mL，混匀，置磁力分选架上静置2 min，吸弃DMEM，重复3次，最后用90 μL DMEM（含10% FBS）重悬。取10 μL大鼠抗小鼠CD31单克隆抗体加入上述磁珠DMEM中合成100 μL，混匀，4 ℃冰箱孵育过夜，期间反复振荡。实验当天在超净台内用DMEM漂洗心肺组织2次，肺周缘组织剪碎成尽可能小的组织块。加入10 mL I型胶原酶（1 mg/mL），置培养箱中消化60 min，每15 min振荡1次。1 000 r/min离心5 min，弃上清，用预热的10 mL DMEM（含10% FBS）重悬。用200目细胞滤网将细胞过滤到无菌离心管中，反复离心重悬2次，最后用DMEM（含10% FBS）重悬成细胞悬液。细胞计数，稀释成细胞数1×107/mL的细胞悬液，分装至1.5 mL EP管内，每个EP管中加入1 mL细胞悬液。取出提前配制的CD31抗体磁珠用DMEM（含10% FBS）清洗4次后加入细胞悬液中。混匀后置4 ℃冰箱孵育，每10 min轻微振荡1次。2 h后将EP管静置磁力分选架上，10 min后吸弃上清液。加入1 mL ECM培养基反复清洗后转入1%明胶包被的6孔板内，置培养箱培养，1只小鼠肺组织分离获得的细胞在同一孔内培养。48 h后换液除去磁珠，此后每2 d换液1次。

1.2.3细胞传代：细胞长至80%～90%融合时即可传代，吸出原有培养液，PBS液清洗后加入0.25%胰蛋白酶。消化2～3 min，显微镜下观察细胞间连接疏松，细胞成片收缩时吸出消化液，加入DMEM（含10% FBS）终止消化。用吸管反复吹打，收集细胞悬液至离心管，1 000 r/min离心5 min。弃上清，ECM培养基重悬，培养箱中继续培养。首次传代细胞传至25 cm培养瓶内培养，此后按1:2传代。

1.2.4细胞形态学观察：利用倒置显微镜观察细胞生长情况及形态学变化，计算小鼠PMVECs原代培养成功率、从原代培养开始到首次传代所需时间。

1.2.5PMVECs的鉴定：采用免疫荧光细胞化学染色法检测VI I I因子相关抗原。培养的第2代细胞接种至放有盖玻片的6孔板内，制备细胞爬片。100%甲醇-20 ℃固定20 min，0.2% Triton X-100穿膜15 min，3% H2O2孵育15 min，封闭血清封闭20 min。滴加兔抗人VI I I因子相关抗原（1:200）50 μL，4 ℃孵育过夜，滴加荧光标记的羊抗兔IgG（1:100）室温避光孵育1 h，随后缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察、摄片。阴性对照选PBS代替一抗。

1.2.6PMVECs纯度的测定：采用1.2.5的方法将PMVECs上的VI I I因子相关抗原染成绿色，在荧光显微镜下随机选取5个视野观察免疫荧光染色阳性的PMVECs，计算出阳性细胞个数，并计算同一视野普通光条件下细胞总数，实验重复3次，根据下列公式计算PMVECs的纯度。

PMVECs纯度=（阳性细胞数/细胞总数）×100%

1.2.7PMVECs生长曲线的测定：取第2代培养细胞，0.25%胰蛋白酶消化、离心后加入ECM培养基制成单细胞悬液，计数后（每孔1×107个）接种于96孔板内，每孔接种100 μL，设空白组。第2天起每天取5孔细胞，用200 μL DMEM换液，加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，置培养箱孵育4 h后小心吸弃上清，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，用酶联免疫分析仪于490 nm波长处检测各孔光吸收值（OD值），连续测定10 d，未测定细胞每3 d换液1次，以时间为横轴，平均OD值为纵轴绘制细胞生长曲线。

1.3统计学处理方法 采用SPSS19.0软件进行统计学处理。计量资料用表示，样本均数的比较采用方差分析，以LSD法进行两两比较，样本率的比较采用行×列的x2检验，以行×列表分割后进行两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1细胞形态学观察 3种培养方法的细胞生长情况及形态学变化如下：①酶消化法组：4次原代培养2 d后见大量未贴壁细胞，换液后仅遗留少许圆形贴壁不良细胞，未见内皮细胞生长，其他11次见细胞贴壁生长，显微镜下可见短梭形、多边形等内皮细胞生长，存在较多圆形贴壁不良细胞，换液后不能除去，传代后细胞体积增大，生长活性降低，很少能汇合长满培养瓶底（见图1A）；②组织贴块法组：2次出现细菌污染，2次未见内皮细胞游出，6次原代培养至21 d细胞仍未能长满培养板底，不能进行传代，5次在培养24 h后PMVECs开始游出，60 h后游出的内皮细胞及红细胞围绕组织块周围，多次换液后红细胞可除去，培养细胞多呈短梭形、多边形，融合的单胞层具有血管内皮细胞典型的铺路石样形态，纯度高，杂细胞少（见图1B）；③免疫磁珠分选法组：2次培养2 d后仅见少量PMVECs贴壁生长，继续培养后不能长满培养板底部，1次经第2次传代后生长缓慢，培养15 d仍未长满培养瓶底，其他12次细胞传代后生长良好，原代培养2 d后可见免疫磁珠附着在细胞表面，经换液后大多磁珠从细胞表面脱落（见图1C），细胞融合成单层呈典型铺路石样排列，纯度高，过度生长时呈纺锤状，传代后细胞增殖活跃，3～5 d可再次传代。

图2　小鼠PMVECs VI I I因子相关抗原免疫荧光染色阳性（×200）

2.2免疫荧光法检测VI I I因子相关抗原 荧光显微镜下，经免疫荧光染色的培养细胞胞浆呈绿色荧光，细胞呈短梭形、多边形（见图2），阴性对照无荧光染色，证实所培养细胞为内皮细胞。

2.33组原代培养PMVECs成功率的比较 将能进行2次以上细胞传代视为原代培养成功1次。免疫磁珠分选法组成功率明显高于其他2组，差异有统计学意义（P＜0.01），组织贴块法组成功率明显高于酶消化法组，差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。

表1　3组原代培养小鼠PMVECs成功率、首次传代所需时间及纯度的比较

2.43组培养PMVECs从原代培养开始到首次传代所需时间的比较 酶消化法组首次传代时间明显短于其他2组，差异有统计学意义（P＜0.05），免疫磁珠分选法组首次传代时间明显短于组织贴块法组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.53组培养PMVECs第2代纯度的比较 免疫磁珠分选法组纯度显著高于酶消化法组（P＜0.01），组织贴块法组纯度显著高于酶消化法组（P＜0.01），免疫磁珠分选法组与组织贴块法组差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.63组培养PMVECs生长曲线的比较 免疫磁珠分选法组细胞活性明显高于酶消化法组（P＜0.01），免疫磁珠分选法组细胞活性高于组织贴块法组（P＜0.05），组织贴块法组细胞活性明显高于酶消化法组（P＜0.01），见图3。

图3　3组培养小鼠PMVECs生长曲线

3　讨论

自1973年首次体外成功培养人脐静脉内皮细胞以后［1］，内皮细胞原代培养技术不断改进，但是大多为大血管内皮细胞培养，而微血管内皮细胞在细胞形态、基因表型及功能上与其都有很大区别，并且微血管内皮细胞表现为组织器官特异性。故在对炎症、感染、免疫、肿瘤的生长及移植排斥反应等微血管病变的研究中应选取微血管内皮细胞作为研究的细胞模型［2］。目前用于微血管内皮细胞原代体外培养的方法主要有酶消化法、组织贴块法和免疫磁珠分选法。

酶消化法中，本研究采用Kim等［2］报道的培养方法并进行适当改进，运用中性蛋白酶联合IV型胶原酶分离PMVECs。实验中我们发现该法虽能快速从小鼠肺组织中获得PMVECs，但是出现了众多文献中所报道的问题，如细胞纯度不高，重复试验成功率低，经传代后细胞活性低，消化时间、酶浓度较难把握。组织贴块法是目前应用较多的PMVECs培养方法，该法避免了消化酶的化学损伤及组织剪碎过程对细胞的机械损伤［5］。在培养过程中，采用了高润娣等［3］报道的PMVECs培养方法并适当改进。在实验中能获得高纯度的小鼠PMVECs，但是由于剪取的小鼠肺周缘组织量少，经过60 h贴壁组织周边游走出的内皮细胞量少，且分布不均匀，很难形成单层生长，延长了原代培养周期，以致在首次传代时很多细胞出现老化现象，降低了培养成功率及细胞活性。最后本研究沿用了Hewett等［4］的微血管内皮细胞培养方法并进行了改进，采用I型胶原酶消化肺组织获得细胞悬液，再利用CD31抗体磁珠阳性分选获得短梭形、多边形的细胞，密度高时呈典型的铺路石样排列，VI I I因子相关抗原免疫荧光染色呈阳性，鉴定为微血管内皮细胞。细胞数量多，生长快，细胞纯度高，可达80%以上，并且原代培养7 d可进行传代，传代后细胞生长活性好。该法既克服了酶消化法纯度低，细胞活性差的缺点，又克服了组织贴块法细胞数量少，原代培养周期长的缺点，是一种较高效的PMVECs原代培养方法。该方法的最大缺点是抗体磁珠费用高，细胞培养成本高，因此限制了其大规模使用，本研究采用羊抗兔IgG磁珠与大鼠抗小鼠CD31单克隆抗体自行制备CD31抗体磁珠，而非直接购买抗体磁珠，大大降低了成本。随着细胞传代次数增多，细胞体积逐渐增大，生长速度减慢，这可能是长期体外培养条件不适合细胞生长引起的终末分化等引起。实验中发现5代内细胞生长快且形态稳定，适合临床与基础实验研究。

［1］ SAKAO S，TARASEVICIENE-STEWART L，WOOD K，et al. Apoptosis of pulmonary microvascular endothelial cells stimulates vascular smooth muscle cell growth［J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2006，291（3）： L362-368.

［2］KIM N S，KIM S J. Isolation and cultivation of microvascular endothelial cells from rat lungs： effects of gelatin substratum and serum［J］. Yonsei Med J，1991，32（4）： 303-314.

［3］高润娣,曹婕,卢珊,等. 小鼠肺微血管内皮细胞的培养鉴定及其血管形成功能的研究[J]. 中国病理生理杂志,2012,28(1): 186-188,192.

［4］HEWETT P W，MURRAY J C. Human lung microvessel endothelial cells： isolation，culture，and characterization［J］. Microvasc Res，1993，46（1）： 89-102.

［5］陈瑞华,赵自刚,牛春雨,等. 大鼠肺微血管内皮细胞的培养[J]. 中国微循环,2007,11(1): 16-19.

（本文编辑：赵翠翠，丁敏娇）

Comparison of different methods for mouse pulmonary microvascular endothelial cells culture

ZHOU Lingping，FENG Cheng，TANG Xuebin，XU Honglei. Department of Pulmonary and Critical Care Medicine，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou，325015

Objective： To explore an effcient and stable method for the mouse pulmonary microvascular endothelial cells （PMVECs） culture. Methods： Forty-fve 1 week old Balb/c mice were randomly divided into three groups. Mouse PMVECs were isolated and cultured respectively by enzyme digestion method，explants method and immunimagnetic beads method. Cells were identifed by morphological observation and VIII factor related antigen immunofuorescence staining. The success rate of primary culture and the time required from primary culture to the beginning of the frst passage was calculated，the cell purity was determinated，growth curves were drew by MTT method. Results： Short spindle and polygonal microvascular endothelial cells were observed in all of the three methods. Those cells were positive to the VIII factor related antigen. The success rate and cell activity in immunomagnetic beads method group increased signifcantly compared with the other two groups （P＜0.01）. As for the time required from primary cultured to the beginning of the frst passage，it decreased in immunomagnetic beads method group compared with the explant method group （P＜0.05）. And the purity increased significantly in immunomagnetic beads method group compared with the enzyme digestion method group （P＜0.01）. Conclusion： Immunomagnetic beads method is of higher repeatability，rapider separation，and obtains much higher purity and better activity mice PMVECs.

cell culture； primary culture； immunomagnetic beads； pulmonary microvascular endothelial cells

R331

B DOI： 10.3969/j.issn.2095-9400.2016.08.010

2015-06-08

浙江省自然科学基金资助项目（LY12H01001）。

周玲萍（1987-），女，浙江龙泉人，住院医师。

徐红蕾，教授，Email：601282329@qq.com。