草鱼鱼鳞胶原蛋白酸酶分步提取工艺研究

陈铁壁> 刘冬敏鹿　康王建辉周　强邓胜国李梦群

(1. 湖南科技学院化学与生物工程学院，湖南 永州　425199；2. 长沙理工大学湖南省水生资源食品加工工程技术研究中心，湖南 长沙　410114)



草鱼鱼鳞胶原蛋白酸酶分步提取工艺研究

陈铁壁1> 刘冬敏1鹿康2王建辉2周强1邓胜国1李梦群1

(1. 湖南科技学院化学与生物工程学院，湖南 永州425199；2. 长沙理工大学湖南省水生资源食品加工工程技术研究中心，湖南 长沙410114)

为实现鱼鳞胶原蛋白的高效提取，在优化脱钙、混酸法和酶法提取工艺基础上，对鱼鳞胶原蛋白的酸酶进行分步提取。研究发现，鱼鳞最佳脱钙工艺为料液比8∶100(g/mL)，盐酸浓度1.0 mol/L，反应时间1.0 h，反应温度20 ℃；混合酸法提取鱼鳞胶原蛋白的最佳条件为醋酸料液比1∶12(g/mL)，柠檬酸料液比1∶10(g/mL)，乳酸料液比1∶12(g/mL)，即混合酸料液比为1∶34(g/mL)，其中，0.8 mol/L柠檬酸、1 mol/L乳酸、0.8 mol/L醋酸的体积比为6∶5∶6，提取时间2 d，胶原蛋白的提取率为48.14%；最佳酶法提取条件为胃蛋白酶用量450 U/g，提取温度30 ℃，提取时间72 h，该条件下提取率为45.26%。酸酶耦合法优于单一方法或同种方法两次提取的效果，可实现酸溶性和酶溶性胶原蛋白的连续提取，先酸后酶法胶原蛋白的提取率达84.61%，SDS-PAGE凝胶电泳发现其为I型胶原蛋。

草鱼；鱼鳞；酸提；酶提；胶原蛋白

中国是世界上水产品产量最大的国家，也是世界上唯一养殖量超过捕捞量的国家，水产品产量占世界总产量的1/3左右。2014年中国水产品总量达6 461.52万t，淡水产品产量3 165.30 万t，占总产量的48.98%，同比增长4.36%[1]，其中，淡水养殖鱼类中，草鱼产量最高，为537.68万t。据统计，中国每年鱼的废弃物总量达200万t左右[2]，其中15%是鱼鳞，约30万t[3]，若处理不当，浓烈的鱼腥味或发臭气味势必给周围环境带来巨大影响。对其副产物进行精细加工，不但可提高水产品加工的附加值，安置渔区部分剩余劳动力，而且可带动如加工机械业等相关行业的发展，具有明显的经济和社会效益。

鱼鳞胶原蛋白因其多功能性，已逐渐受到广大研究者的关注，对鱼鳞胶原蛋白的研究和应用业已渗入多个行业和领域。然而，目前中国该产业尚处于初级收集阶段，其中，鱼鳞胶原蛋白提取工艺耗时长，成本高，提取率不高是主要的瓶颈难题[4-5]。是故，更为安全、高效、低成本的提取方法的研发已成为实现其高值利用的关键。国内外对于鱼鳞胶原蛋白的提取及其功能性研究颇多，但均以单一酸法或酶法提取为主。研究发现，酸溶性胶原蛋白和酶溶性胶原蛋白之间在分子构型、氨基酸组成等方面的差异不明显[6]。本研究拟采用酸酶分步法提取草鱼鱼鳞胶原蛋白，旨实现鱼鳞胶原蛋白的高效提取，为其高效利用提供理论和技术支持。

1　材料与方法

1.1试验材料

草鱼鱼鳞：湖南省益阳益华水产品有限公司，经清水反复清洗后晾干，用万能粉碎机磨成粉状后，于4 ℃以下保存，备用。

1.2化学试剂

柠檬酸、醋酸、乳酸、氯化钠、乙醇：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

高氯酸：分析纯，北京兴瑞达化工厂；

EDTA：分析纯，长沙湘科精细化工厂；

铬黑T：分析纯，上海迈坤化工有限公司；

盐酸：分析纯，衡阳市凯信化工试剂有限公司；

氢氧化钠：分析纯，津市风船化学试剂科技有限公司；

L-羟脯氨酸：分析纯，上海安耐吉化学有限公司；

胃蛋白酶：≥1 200 U/g，国药集团化学试剂有限公司。

1.3主要仪器

数显恒温水浴锅：HH-6型，郑州佳创仪器设备有限公司；

紫外分光光度计：UV-100型，天津市普瑞斯仪器有限公司；

恒温磁力搅拌器：HJ-3型，苏州江东精密仪器有限公司；

台式pH计：DD.27-Delta320型，北京卓川电子科技有限公司；

电子分析天平：FA2004型，北京衡器厂有限公司；

真空冷冻干燥机：FD-1型，长沙太康仪器设备有限公司；

马弗炉：LX/10型，常州市兴光窑炉有限公司；

台式离心机：DT5-6A型，北京时代北利离心机有限公司；

万能粉碎机：FW100型，东西仪科技有限公司。

1.4试验方法

1.4.1草鱼鱼鳞的基本成分分析

(1) 水分测定采用直接干燥法：按GB/T 5009.3—2003执行。

(2) 粗蛋白测定采用量凯氏定氮法：按GB/T 5009.5—2003执行。

(3) 粗脂肪测定采用索氏抽提法：按GB/T 5009.6—2003执行。

(4) 灰分测定采用马弗炉灰化法：按GB 5009.4—2003执行。

1.4.2胶原蛋白含量的测定采用Woessner比色法[7]157-158。胶原蛋白的含量由所测羟脯氨酸含量乘以相关系数即得，同一种鱼鳞相关系数一定，胶原蛋白的提取率可表示为：

(1)

1.4.3鱼鳞脱钙工艺研究Ca2+标准曲线的绘制参照王信苏等[8]的方法，以铬黑T为指示剂，用0.075 mol/L EDTA溶液滴定，得EDTA消耗量与Ca2+浓度关系的标准曲线y=2.711x+0.184 9(R2=0.998 2)。根据以往研究报道[7] 1-81[8-10]，脱钙工艺研究按表1因素水平表进行正交试验，根据EDTA消耗量计算溶液中Ca2+浓度，以脱钙率为指标，筛选出最佳脱钙工艺。

表1　脱钙因素水平表

1.4.4酸法提取胶原蛋白胶原蛋白的酸法提取中以往多以柠檬酸、乳酸、醋酸等单一酸水解，提取时间需3d[3,10]；本试验在鱼鳞脱钙处理后，采用浓度为0.8 mol/L柠檬酸、1 mol/L乳酸、0.8 mol/L醋酸，在20 ℃下，磁力搅拌提取2 d，按表2因素水平表采用混合酸法进行胶原蛋白的提取，以胶原蛋白的提取率为评价指标，筛选最佳酸法提取工艺。

表2　酸法提取胶原蛋白因素水平表

1.4.5酶法提取胶原蛋白鱼鳞脱钙后，根据以往研究[11-14]，分别选取提取温度、提取时间、胃蛋白酶用量为考察因素，按表3因素水平表进行正交试验，以胶原蛋白的提取率为评价指标，筛选最佳酶法提取工艺。

1.4.6酸酶分步法提取胶原蛋白选取上述两种提取胶原蛋白的最优方案，分别采用酸—酸、酸—酶、酶—酶、酶—酸二次提取法，以胶原蛋白提取率为判断标准筛选最优试验方案。

表3　酶法提取胶原蛋白因子水平表

1.4.7胶原蛋白的纯化参考段宙位等[15]的方法，并稍作修改。取1.4.6中所得粗蛋白，加入NaCl至溶液终浓度为3.0 mol/L，于4 ℃条件下6 000 r/min离心10 min，重复两次，透析，冷冻干燥，所得样品即为纯化后的胶原蛋白。

1.4.8十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)分析参考周爱梅等[16]的方法略加改进。先配制 2.0 mg/mL的胶原蛋白溶液，与添加有SDS、甘油、溴酚蓝、β-巯基乙醇的Tris—HCl缓冲液混合，在沸水里加热3 min，冷却备用。用7.5%的丙烯酰胺对胶原蛋白进行电泳分析，电泳条件为200 V、2.0 h。采用考马斯亮蓝R250染色，用体积分数为7.5%的醋酸和5% 的甲醇脱色。

1.5数据分析

结果以平均值表示，显著性统计采用SAS 9.2统计软件的单因素方差分析，并进行Duncan氏多重比较，P<0.05表示差异显著。

2　结果与讨论

2.1鱼鳞的基本成分

由表4可知，草鱼鱼鳞中粗脂肪含量为0.51%，蛋白质含量丰富，达60.02%，其灰分含量高达24.37%。因鱼鳞中的灰分和脂肪均可能阻碍提取液与鱼鳞间的接触，直接影响到鱼鳞胶原蛋白的提取，且鱼鳞灰分中钙质多以羟基磷灰石形式存在，黏附于胶原纤维的表面[17-18]，因此，在提取鱼鳞胶原蛋白过程中，首先必须使胶原蛋白脱离磷灰石晶格的束缚而溶出[19-20]。因鱼鳞中粗脂肪含量较低，本试验提取前的预处理主要对鱼鳞进行脱钙处理。

表4　鱼鳞中各组分的含量†

†各组分均以干基计。

2.2鱼鳞脱钙工艺优化

选定料液比、时间、温度、盐酸浓度4因素进行L9(34)正交试验，由表5可知，影响鱼鳞脱钙效果的各因素中主次关系依次为：温度(D)>料液比(A)>盐酸浓度(C)>时间(B)，脱钙最优方案为A2B2C3D1，即以1.0 mol/L盐酸为脱钙液，料液比为8∶100(g/mL)，在20 ℃下提取1.0 h。

表5　脱钙正交试验表

2.3胶原蛋白的酸法提取工艺优化

当前用于鱼鳞胶原蛋白提取的试剂多以可食用的柠檬酸、醋酸、乳酸为主，因此提取法无需严格的后续脱酸工艺。但在以往研究中，胶原蛋白的提取研究均用单一酸，其得率均不高。本研究分别以柠檬酸、乳酸和醋酸的料液比三因素进行L9(34)正交试验。由表6可知，影响混合酸法提取鱼鳞胶原蛋白的主次因素依次为：醋酸(B)>柠檬酸(A)>乳酸(C)，其最佳混合酸的料液比为1∶34(g/mL)，其中，0.8 mol/L柠檬酸、1 mol/L乳酸、0.8 mol/L醋酸的体积比为6∶5∶6。验证实验发现，按最优混酸提取方案，磁力搅拌提取时间2 d，胶原蛋白的提取率达48.14%。

表6　酸法提取胶原蛋白正交试验表

2.4胶原蛋白的酶法提取工艺优化

胶原蛋白变性温度较低，在32 ℃左右，因胃蛋白的易获得性，且价格不高，最适温度相近，同时，胃蛋白酶对胶原蛋白的有限水解可增大胶原蛋白的溶解度。是故，本研究选用胃蛋白酶，在正交试验设计时，选择反应温度小于32 ℃。由表7可知，影响酶法提取鱼鳞胶原蛋白的主次因素依次为：A(温度)>C(酶用量)>B(时间)，最佳提取条件为：酶用量450 U/g，于30 ℃条件下提取72 h，此时提取率为45.26%。

表7　酶法提取胶原蛋白正交试验表

2.5胶原蛋白的酸酶分步法提取

由表8可知，酸酶分步法均显著提高了鱼鳞胶原蛋白的提取率(P<0.05)，且先酸后酶法优于先酶后酸法(P<0.05)，其提取率分别为84.61%，76.65%。可能缘于先酸后酶法通过破坏鱼鳞的表面结构，使胃蛋白酶更容易渗入到鱼鳞中，有利于胃蛋白酶发挥酶解作用，从而提高了胶原蛋白的提取效率。

2.6SDS-PAGE凝胶电泳结果

由图1可知，酸酶分步法提取的鱼鳞胶原蛋白含有两条α肽链(α1、α2，分子量分别约为120，110 kD)和一条β聚合链(α的二聚体，分子质量约为200 kD)，与钟朝辉等[14]的研究结果相似，可初步确定酸酶分步法提取的鱼鳞胶原蛋白为I型胶原蛋白，图谱中无其他条带，可见酸酶分步法所提胶鱼鳞原蛋白纯度较高，且未变性。

表8　酸酶耦合法试验方案及其结果†

†同列上标不同表示差异显著( P<0.05) 。

M. 次高分量标准蛋白Marker

3　结论

本研究以草鱼鱼鳞为研究对象，探索鱼鳞胶原蛋白的高效提取工艺，系列研究发现：鱼鳞最佳脱钙工艺为料液比8∶100(g/mL)，盐酸浓度1.0 mol/L，20 ℃条件下反应1.0 h；采用三酸(柠檬酸、乳酸、醋酸)联用，胶原蛋白的提取率为48.14%，较单一酸法提取大大节省了提取时间；酶法提取在胃蛋白酶活性范围之内，其最佳提取工艺为：酶用量为450 U/g，于30 ℃条件下提取72 h；采用酸酶分步法鱼鳞胶原蛋白的提取率均显著高于单一提取方法或同种方法两次提取的效果(P<0.05)。本研究实现了酸溶性胶原蛋白和酶溶性胶原蛋白的连续提取，能保持胶原蛋白原有结构不变，能更为有效地利用鱼鳞蛋白，减少资源浪费和环境污染，对鱼鳞蛋白乃至淡水鱼加工副产物的高效利用具有很好的技术和理论指导意义。

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Combinated use of enzyme and acid for collagen extraction from fish scales>

CHEN Tie-bi1LIUDong-min1LUKang2WANGJian-hui2ZHOUQiang1DENGGuo-sheng1LIMeng-qun1

(1.DepartmentofBiologyandChemistry,HunanUniversityofScienceandTechnology,Yongzhou,Hunan425100,China;2.HunanProvincialEngineeringResearchCenterforFoodProcessingofAquaticBioticResources,ChangshaUniversityofScienceandTechnology,Changsha,Hunan410114,China)

In order to realize the efficient extraction of collagen from fish scales, acid-enzyme coupling methods was used for collagen extraction based on the optimized decalcification, mixed-acid and enzymatic extraction. The optimum decalcification of fish scales was as follows. The solid to liquid ratio was 8∶100, soluted in 1.0 mol/L hydrochloric acid, and then reaction at 20 ℃ for 1.0 h. The best conditions for collagen extraction using mixed acid were 1∶12 of acetic acid, 1∶10 of citric acid, and 1∶12 of lactic acid for 3 d extraction and the extraction yield of it was 48.14%. The best enzymatic extraction conditions were shown to be 450 U/g of pepsin at the extraction temperature of 30 ℃ for 72 h and the yield was 45.26%. Acid-enzyme coupling method showed better effect than acid or enzymatic extraction only, even though repeating them twice respectively was not as effective as the coupled one, in spite of relatively high cost and time-consuming (P<0.05). We could obtain 84.61% of the collagen using mixed acid followed by enzymatic extraction , and the extracted collagen was identified to be type I one using SDS-PAGE.

Grass carp; fish scale; acid extraction; enzymatic extraction; collagen

国家自然科学基金青年科学基金项目(编号：31301564)；湖南省自然科学基金项目(编号：2015JJ2011)；湖湘青年英才支持计划项目(编号：2015RS4051)；永州市科技局科技计划项目(编号：永科发[2009]20号)；湖南省高校科技创新团队支持计划资助(编号：2012-318)； 湖南省水生资源食品加工工程技术研究中心开放基金资助项目(编号：2016GCZX02，2015GCZX08)

陈铁壁，男，湖南科技学院实验师，硕士。

王建辉(1980-)，男，长沙理工大学教授，博士。

E-mail:wangjh0909@163.com

2016—05—11

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.040