莪黄汤保留灌肠对人结肠癌SW480移植瘤生长及VEGF表达的影响*

侯俊明　任占良　侯杰军　杨得振　董　明　魏　辉　贾　奇　任小朋　贾　勇

陕西中医药大学(咸阳 712000)



莪黄汤保留灌肠对人结肠癌SW480移植瘤生长及VEGF表达的影响*

侯俊明任占良▲侯杰军△◇杨得振△董明△魏辉△贾奇△任小朋△贾勇△

陕西中医药大学(咸阳 712000)

目的：研究莪黄汤对人结肠癌SW480移植瘤生长及VEGF的影响。方法：选健康SPF级BALB/c小鼠2只，雌性，年龄4～6周，体重18～22g；健康SD大鼠40只，体重200±15g。造模后，40只SD大鼠随机分为模型组、对照组、阳性对照组、莪黄汤高剂量组、莪黄汤低剂量组，每组10只,接种后1周开始给药治疗。四组均给予饲料、自由饮用水，分别用相应药物干预处理2周。观察莪黄汤对人结肠癌SW480移植瘤生长及抑瘤作用的影响，运用S-P免疫组化法分析移植瘤内血管内皮生长因子的表达。结果：莪黄汤对SW480移植瘤大鼠瘤体生长有抑制作用，但弱于5-FU；该药等促进大鼠胸腺、脾脏的生长，提升了机体的免疫力及抗肿瘤能力；阳性对照组与药物组对SW480移植瘤大鼠VEGF表达的影响相近；可抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞的凋亡。结论：莪黄汤对SW480移植瘤细胞的生长有明显抑制作用，减少SW480移植瘤表达VEGF，促进肿瘤细胞凋亡。

主题词结肠肿瘤灌肠@莪黄汤动物，实验

中医药抗肿瘤治疗既能扶正、增强机体免疫功能，又能杀灭肿瘤细胞，还能活血并改善高黏高凝状态，在肿瘤治疗过程中发挥着重要的作用[1]。本次实验通过对SW480荷瘤大鼠免疫功能影响的研究，探讨了莪黄汤对人结肠癌移植瘤的抑瘤作用及对VEGF表达的影响。

1材料1.1实验材料健康SPF级BALB/c雌性小鼠2只，鼠龄4～6周，体重20±2g；健康SD大鼠40只，体重200±15g；以上动物均购自第四军医大学实验动物中心，其中健康SPF级BALB/c小鼠代养在第四军医大学动物实验中心SPF条件下的超净层流笼中；人结肠癌SW480细胞株购自第四军医大学实验动物中心。莪黄汤组方：莪术、大黄、昆布、薏苡仁。阳性对照药物：5-FU购自陕西中医学院附属医院。(批准文号：国药准字H31020593，规格0.25g/支)。实验试剂盒：鼠抗人VEGF免疫组化试剂(产品货号：A003-3)。

2实验方法2.1造模及分组灌肠将莪黄汤生药80g，煎汤浓缩为生药含量为4g/ml冷藏备用(陕西中医学院药理实验中心制备)，用前稀释至所需浓度。选健康SPF级BALB/c小鼠2只，雌性，年龄4～6周，体重18～22g；健康SD大鼠40只，体重200±15g。在健康SPF级BALB/c小鼠背部种植人结肠癌SW480细胞，制成实体瘤模，观察两周后成瘤率100%[2]。成瘤后即处死瘤鼠，消毒皮肤，切下瘤块，选用合适部位于生理盐水中剪成直径2mm的瘤块备用。40只SD大鼠经适应性喂养3d后进行瘤体种植手术；术前禁食12 h，以10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉，常规安尔碘消毒腹部皮肤，选择下腹正中切口，打开腹腔，将制备好的瘤块植入距回盲部约5cm处肠系膜侧的浆膜面凹龛中[3]。术后所有大鼠暂时分笼饲养至完全清醒后给予正常饮食。以《药理学实验》给药方法，莪黄汤组结肠给药，按低剂量组4g/kg/d，高剂量组40g/(kg·d)[4]。5-FU结合临床用药原则，按公式计算，每只大鼠腹腔注射50mg/kg，隔日。

所有SD大鼠全部苏醒，按根据随机数字表分组的方法分为4组，模型对照组[用蒸馏水按10ml∕(kg·d)体重灌肠]；阳性对照组(腹腔注射5-FU，给药剂量为50mg/kg,隔日)；莪黄汤高剂量组[2ml(8g)/(d·只)]；莪黄汤低剂量组[2ml(0.8g)/(d·只)]，每组10只。接种后1周开始给药治疗，均给予饲料、自由饮用水，分别用相应药物干预处理2周。观察SD大鼠一般情况；各组SD大鼠体重的变化；SW480移植瘤的生长状况。计算抑瘤率抑瘤率(%)=[(模型组平均瘤重-用药组平均瘤重)/模型组平均瘤重×100%]及脾脏(胸腺)指数脾脏(胸腺)指数=[脾脏(胸腺)重量(mg)/大鼠体重(g)]。S-P免疫组化分析法测定各组VEGF的表达。

2.2统计学方法实验数据以均值±标准差表示，数据采用SPSS17.0统计软件进行数据分析，P<0.05为有统计学意义。

3结果3.1SD大鼠生活状况观察造模前所有大鼠生活状况良好。接种后1周内，未见异常，各组大鼠均成瘤成功，成瘤率为100%。给药2周以后，体重变化情况模型组较其它组均有减轻，进食及饮水量明显减少，体毛杂乱暗淡无光。阳性对照组明显出现脱毛、体毛杂乱、无光泽，较模型组体重明显减轻。莪黄汤各组大鼠体重明显增长，日进食、水量增加，活动好。模型组1只大鼠因全身衰竭死亡。

3.2给药前后对各组大鼠体重的影响SD大鼠接种第7天与用药后第15天体重比较，用药后体重与模型组比较阳性对照组降低，差异具有统计学差异(P<0.01)，与模型组比较莪黄汤组均升高，升高程度统计学差异显著(P<0.01)；莪黄汤组体重均高于阳性对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1　给药前后SD大鼠体重变化比较(g)

3.3药物对大鼠瘤体重量及抑瘤率的影响对实验大鼠进行药物灌肠，灌肠后2周，严格称取SD大鼠体重，瘤体重量及抑瘤率分析结果见表2。从结果来看，实验鼠的体重两组存在显著差异，与阳性对照组的大鼠体重比较比较，莪黄汤组的大鼠体重均较高(P<0.05)。

表2　药物对SW480移植瘤大鼠瘤体重量及抑瘤率的影响

3.4药物对SW480移植瘤大鼠免疫器官指数的影响与模型组比较，阳性对照组指数均降低(P<0.05)，与阳性对照组比较，莪黄汤组均较高(P<0.05)，见表3。

表3　药物对SW480移植瘤大鼠脾脏、胸腺指数的影响(mg/g)

3.5药物对SW480移植瘤大鼠瘤组织中VEGF的影响与模型对照组比较，阳性对照组、莪黄汤高剂量组表达VEGF明显下降，莪黄汤低剂量组VEGF表达有所下降；莪黄汤高剂量组与阳性对照组比较无明显差异，说明莪黄汤与5-FU对SW480移植瘤大鼠VEGF的表达影响相近，见表4。

表4　药物对SW480移植瘤大鼠瘤组织中VEGF的影响

4讨论运用莪黄汤保留灌肠，在改善结直肠癌术后患者排便功能、围放疗期患者的临床表现，改善肿瘤周围组织手术条件，增强新辅助治疗效果，缩短了新辅助治疗的时间，提高患者的生活质量方面取得了一定的疗效[5]。莪黄汤联合化疗能在一定程度上下调患者结直肠癌组织中VEGF的表达，上调E-Cadherin的表达，抑制肿瘤新生血管生成，从而抑制肿瘤的复发及转移[6]。

以往的研究中发现益气活血类中药可通过影响SDF-1/CXCR4通路等,调节血管生成,从而治疗血管生成异常的疾病；而从莪术中提取莪术醇和β—榄香烯的抗肿瘤作用尤其突出[7]。李传伟等[8]探讨了莪术油对小鼠结肠癌抑制作用及机制。冯刚等[9]通过实验证明莪术油对肿瘤血管形成有明显抑制作用。大黄素抗肿瘤、抗炎症等多种生物学作用已经有报道[10]。 王庭欣等[11]认为昆布多糖是通过细胞免疫和非特异性免疫而实现对小鼠的抑瘤作用。冯刚等[12]发现薏苡仁具有明显抑制S180肉瘤生长的功效。

本实验提示莪黄汤对SW480移植瘤大鼠瘤体的生长有抑制，但弱于5-FU。与模型对照组比较，莪黄汤各剂量组可增强SD大鼠免疫力，具有显著性差异；与阳性对照组比较，莪黄汤各剂量组SD大鼠胸腺指数、脾脏指数显著升高；与模型组相比，5-FU组SD大鼠免疫力明显降低，显示了5-FU对大鼠的脾脏和胸腺较强的损伤作用。莪黄汤各剂量组与阳性对照组相比较，莪黄汤能够促使大鼠的胸腺、脾脏生长，能改善机体的免疫功能，增强抗肿瘤的能力。

目前众多研究证实，当肿瘤体积大于2mm3时，就需要新生血管来为肿瘤细胞的生长提供养分。大肠癌的复发和转移同样依赖新生血管的形成。宋寄春等[13]发现半枝莲阻滞了肿瘤细胞由S期向GZ/M期的转变过程，从而引起肿瘤细胞凋亡。崔映宇等[14]发现马尾松树皮提取物抑制人结直肠癌细胞的生长，诱导其凋亡是通过上调P53、P21，下调Bel-2来表达。吕盈盈等[15]发现大黄素通过抑制VEGFR酪氨酸激酶活性来抑制结肠癌细胞的生长。

[1]王建美,章永红.章永红教授治疗肠癌经验探要[J] 陕西中医,2016,37(1)：95-96.

[2]Liu L.Zhang QL.Zhang YF，Lentivirus-mediated silencing of tiam1 gene influences multiple functions of a human colorectal cancer cell line[J].Neoplasia，2006,8(11):917-924.

[3]张国锋，王元和，王强．人结肠癌裸鼠原位种植癌及转移模型的建立[J].中国普通外科杂志，2003,12(11):823-826．

[4]谭毓治，冯冰虹.药理学实验[M].北京：人民卫生出版社,2008：142-143.

[5]侯俊明,魏辉,田博.直肠灌注莪黄汤在低位直肠癌新辅助放疗期的临床应用[J].现代中医药,2011,31(5):34-35.

[6]侯俊明,王磊.莪黄汤联合化疗治疗直肠癌前切除术后综合征疗效观察[J].西部中医药,2012,25(11)：85-87.

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[8]李传伟，徐萸萍，苗芳，等．莪术油抗小鼠结肠癌效应的实验研究[J]．泰山医学院学报，2005,26(2):89-91．

[9]冯刚，黄涛，卢宏达，等．莪术油注射液对小鼠移植性s180肉瘤血管形成的抑制作用[J].肿瘤研究与临床，2005,17(4):233-235．

[10]丁艳，黄志华.大黄素的抗肿瘤作用研究进展[J]．时珍国医国药，2008，19(5)：1272-1273．

[11]王庭欣，蒋东升，马晓彤，等．海带多糖对小鼠H22实体瘤的抑制作用[J]．卫生毒理学杂志，2000,14(4):242.

[12]冯刚，孔志庆，黄冬生，等．肿瘤防治研究[J]．肿瘤，2004,31(4):31-32．

[13]宋寄春，谭诗云，陈明揩.半枝莲对人大肠癌细胞增殖抑制及诱导凋亡的作用[J].咸宁学院学报(医学版)，2007,21(2):106-108.

[14]崔映宇，王宏斌，谢衡，等.马尾松树皮提取物体外抑制人大肠癌细胞生长机理初探[J].中国农业大学学报，2007,12(4):7-14.

[15]吕盈盈，钱家鸣，邱辉忠，等.大黄素对结肠癌血管内皮生长因子受体的影响及对结肠癌抑制作用的研究[J].中国中西医结合消化杂志，2005,13(5):310-313.

(收稿2016-05-07；修回2016-06-20)

*陕西省社会发展科技攻关项目(2012SF2-11-3)

▲陕西户县森工医院(户县710300)

△陕西中医药大学附属医院(咸阳 712000)

R574.62

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2016.09.074