黄瓜枯萎病拮抗菌HM-7的鉴定

唐 蕊，张雪辉，殷世群，万慧洁

（1.邢台学院化学工程与生物技术学院 河北邢台 054001； 2.邢台市林业局 河北邢台 054000）

黄瓜枯萎病是由半知菌亚门尖孢镰孢菌黄瓜专化型[Fusarium oxysporum(Schl.)f.sp.cucumerinumOwen.]引起的一种严重的土传病害，在黄瓜露地和保护地栽培中均有发生，是影响黄瓜生产最主要的病害之一。病菌从幼根或伤口侵入，危害维管束，阻碍水分运输，使植株迅速萎蔫且病势发展迅速，很难控制。发病率一般为10%～30%，严重时可达80%～90%[1-2]。近年来，该病的发生程度日趋严重，严重影响黄瓜的产量，导致经济效益降低，造成巨大损失。目前生产上针对黄瓜枯萎病的防治除了选用抗病品种、结合轮作倒茬或嫁接等栽培管理等农业措施外，配合处理种子与土壤及发病初期施药等化学防治方法进行综合防治。化学药剂主要有青枯立克、恶霉灵、甲霜恶霉灵等，虽然各种药剂交替使用能有效缓解病菌抗药性的产生，但长期使用导致许多菌株出现抗药性，防治效果减弱；另一方面，化学药剂的大量使用，也造成药品残留等食品安全问题。随着人们经济能力的提高、环保意识的加强，对食品质量提出了更高的要求，加之现代农业的发展和《食品安全法》的实施，农产品的安全生产显得尤为重要。利用拮抗菌防治枯萎病属于生物防治，对人畜无害、不污染环境、果实安全性高，成为专家学者研究的热点。近年来主要研究的生防菌类群有真菌类的木霉、丛枝菌根，细菌类的芽孢杆菌、假单胞杆菌和放线菌类的链霉菌属[3-4]。本研究在对黄瓜枯萎病拮抗菌筛选的基础上，通过培养特征观察、显微观察、革兰氏染色、16S rDNA序列分析等对拮抗效果较好的拮抗菌HM-7进行鉴定，为生防制剂的研发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 拮抗菌HM-7（邢台学院微生物实验室从黄瓜种植园土样中分离获得，对黄瓜枯萎病拮抗效果显著的菌株）。

1.1.2 培养基及试剂 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，琼脂 17g，水 1 000 mL。牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水 1 000 mL。马铃薯培养基（PDA）：马铃薯 200g，葡萄糖 20g，琼脂 17g，水 1 000 mL。高氏 I号培养基：可溶性淀粉 20g，KNO31g，NaC1 0.5g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO40.5g，FeSO40.01g，琼脂 17g，水 1 000 mL，pH 7.2～7.4。SK8255 基因组抽提试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌HM-7菌株菌落特征观察 采用平板划线分离法。将活化的生防菌HM-7分别接种至牛肉膏蛋白胨培养基、PDA培养基、高氏I号培养基上，37℃培养，观察不同时间其在不同培养基中的菌落特征。

1.2.2 显微观察和革兰氏染色 选取生长24h的生防菌HM-7进行显微观察，并进行革兰氏染色，在油镜下观察结果[5]。

1.2.3 拮抗菌HM-7基因组DNA的提取 将拮抗菌HM-7的单菌落接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在37℃中，200 r·min-1下震荡培养过夜。取1 mL菌体培养液于EP管中，8 000 r·min-1离心1min，弃上清液。加入 20mg·mL-1的溶菌酶 180 μL，置于37℃水浴锅中保温1h，期间每10min混匀一次。加入蛋白酶K 20 μL，混匀后置于56℃水浴锅中保温30min，过程中每10min摇匀一次。加入20mg·mL-1的 RNA 酶 20 μL，室温放置 3min。加入Buffer BD 200 μL，放置于70℃水浴锅中水浴10min。加入200 μL无水乙醇，充分混匀，放置2min。12 000 r·min-1离心 1min，弃去液体。加入含异丙醇的 PW Buffer 500 μL，10 000 r·min-1离心30 s，弃上清液。加入含无水乙醇的Wash Solution，10 000 r·min-1离心 30 s，弃去液体，再离心 2min,弃去残留液体，置于室温晾干。加入100 μL的CE Buffer 12 000 r·min-1离心 2min，保存 DNA 溶液。过夜后，采用1.0%琼脂糖凝胶80 V电泳检测DNA，采集电泳图像[6-8]。

1.2.4 16S rDNA序列的PCR扩增 将提取的生防菌HM-7基因组DNA进行16S rDNA的PCR扩增[6-8]。 PCR 扩增的 引物 27F：5’GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’；1492R：5’CGGCTACCTTGTTACGACTT 3’。PCR扩增体系：HM-7基因组DNA（100 ng·μL-1）1 μL，正向引物（4 nmol·mL-1）0.5 μL，反向引物（4 nmol·mL-1）0.5 μL，dNTP（10 mmol·mL-1）0.5 μL，10 倍Taq酶缓冲液 2.5 μL，Taq酶（2 U·μL-1）0.2 μL 加水至 25 μL。PCR 扩增程序为预变性94℃5min,变性94℃30 s，退火55℃35 s，延伸 72℃ 1min，35个循环，延伸 8min，扩增完成。采用1.0%琼脂糖凝胶80 V电泳检测DNA，采集电泳图像。

1.2.5 PCR产物收集 将电泳结果PCR产物依据购自上海生工的回收盒标示的使用说明进行回收。

1.2.6 PCR序列测序分析 回收后的PCR产物寄送到生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将拮抗菌HM-7的16S rDNA测序结果在Blast（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）在线分析比对，利用MEGA 5.0中的Neighbor-Joining方法构建系统发育树来鉴定HM-7分类地位，进化性分支模式的稳定性用MEGA 5.0中的Bootstrap分析。

2 结果与分析

2.1 生防菌HM-7培养特征观察

牛肉膏培养基上生长初期，菌落呈米白色，边缘光滑，有突起，水润透明，不产色素。生长后期菌株呈乳白色，边缘呈小波浪状，有明显的突起，褶皱，不产色素，菌株挑起时有拉丝，呈黏稠状（图1）。PDA培养基上生长初期与牛肉膏上相似，后期边缘光滑，突起不明显，菌落外缘有透明圈（图2）。高氏Ⅰ号培养基上仅有很少量菌落生长。

图1 牛肉膏培养基菌落

图2 PDA培养基菌落

2.2 显微观察及革兰氏染色

显微镜下油镜观察，生防菌HM-7菌株为短杆状，具有运动性，革兰氏染色呈阳性（图3）。

图3 革兰氏染色油镜观察

2.3 分子鉴定结果

生防菌HM-7基因组DNA提取琼脂糖凝胶电泳鉴定，采集图像（图4），参照分子量标准可知，HM-7的DNA大小在2 500 bp以上；16S rDNA基因的PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定，采集图像（图5），参照分子量标准条可知16S rDNA片段的长度在1 500 bp左右。16S rDNA测序结果在NCBI上比对，生防菌HM-7与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloquefaciens）、枯草芽孢杆菌（B.subtilissubsp）、萎缩芽孢杆菌（B.subtilissubsp）相似度均达99%，与地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）相似度达98%。利用MEGA软件构建出系统发育树（图6），HM-7与解淀粉芽孢杆菌处于同一分支，亲缘关系更近。结合细菌生长形态观察初步鉴定HM-7为解淀粉芽孢杆菌。

图4 基因组DNA电泳图

图5 PCR产物电泳图

图6 拮抗菌HM-7系统发育进化树

3 讨论与结论

通过对培养特征观察、显微观察、革兰氏染色、16S rDNA序列分析，构建系统发育树，初步鉴定拮抗菌HM-7为解淀粉芽孢杆菌。

由于微生物杀菌剂对环境污染小、果实安全性高，其发展趋势与人类生态环境、食品安全和生物多样性具有良好的相容性，加之现代微生物工业化生产技术的日趋完善，研发可替代化学杀菌剂的微生物杀菌剂是植物病害生物防治研究的重要方面。芽孢杆菌种群庞大，繁殖能力强，耐热、耐酸碱，理化性质稳定，抑菌谱广泛，是研究较为广泛和深入的微生物类群之一，也是应用于植物病害生物防治的生防菌的主要来源之一。我国已研发成功并投入生产的生防芽孢杆菌商品制剂有百抗、麦丰宁、纹曲宁、伊天得、根腐消等[9-11]。本研究中的拮抗菌HM-7被初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌，而解淀粉芽孢杆菌是目前作为生防芽孢杆菌中的主要菌种之一，故其有望开发为生物制剂应用于农业生产。但拮抗菌HM-7的抑菌谱、拮抗物质稳定性、产生条件、分离提取以及拮抗机制等方面均有待进一步试验探索。

随着生物技术的发展，利用分子生物学技术导入拮抗基因研发工程菌株，或是采用诱变育种、原生质体融合育种等技术进一步获得拮抗效果更加卓越的菌株，将成为生防制剂研发的新方向。