尿激酶对大鼠肺成纤维细胞凋亡的影响*

邵景韫　刘 　安　杜旭升　郭　华　陈明伟

西安市中心医院呼吸科(西安710003)



尿激酶对大鼠肺成纤维细胞凋亡的影响*

邵景韫刘 安杜旭升郭华陈明伟▲

西安市中心医院呼吸科(西安710003)

目的：探讨尿激酶(Urokinase，UK)对大鼠肺成纤维细胞凋亡的影响。方法：5只SD雄性大鼠气管内灌注博莱霉素造肺纤维化模型，将模型组肺成纤维细胞与不同浓度的尿激酶培养24～96h，流式细胞术测定细胞凋亡。结果：尿激酶以时间和浓度依赖的方式抑制肺成纤维细胞生长，流式细胞术检测到凋亡小体。结论：尿激酶能抑制肺成纤维细胞增殖，与凋亡有关。

主题词成纤维细胞/药物作用肺细胞凋亡博莱霉素/化学诱导尿激酶/治疗应用模型，动物大鼠

肺纤维化发病隐匿、进展迅速、病死率高，近年来，发病呈上升趋势，严重影响患者生存质量及预后的慢性肺部疾患[1]，其发病机制不明确，无有效治疗手段。临床上应用尿激酶防治炎性胸膜炎形成的胸膜粘连、肥厚的治疗，但肺纤维化方面的研究很少。本研究通过尿激酶对大鼠肺成纤维细胞凋亡的影响，探讨肺纤维化的发生机制。

材料与方法

1材料与仪器注射用盐酸博莱霉素粉剂购于日本化药株式会社，用生理盐水配成5g/ L；尿激酶粉针剂购于天津生物化学制药有限公司；MTT细胞增殖检测试剂盒购于南京凯基生物；Vimentin(种属：小鼠)购于武汉博士德生物工程有限公司；Cy3标记羊抗小鼠IgG购于武汉博士德生物工程有限公司；Triton×100、DAPI购于碧云天生物技术公司；FACSCalibur流式细胞仪购于美国B-D公司。

2实验方法

2.1制备大鼠肺纤维化模型：模型组取清洁级雄性SD大鼠5只购于第四军医大学动物实验中心，平均体重220.5±14.5g，采用Mitsuhashi H方法，氯胺酮按大鼠(40mg/kg)腹腔注射麻醉后，无菌下行颈正中切口，逐层分离暴露气管，气管插管注入0.3～0.5ml(5mg/kg)博莱霉素[2]，立即翻转动物药物在肺内均匀分布，继续饲养。

2.2肺成纤维细胞的分离、培养、纯化与鉴定：取模型组大鼠5只，平均体重220.5±14.5g，处死大鼠，无菌剥离大鼠肺脏，培养大鼠肺成纤维细胞，对第四代细胞进行细胞鉴定，一抗为小鼠Vimentin，二抗为Cy3标记羊抗小鼠IgG对大鼠肺成纤维细胞进行免疫荧光染色，荧光显微镜下鉴定肺成纤维细胞。

2.3MTT法观察尿激酶对肺成纤维细胞增生的作用：取3～5代大鼠肺成纤维细胞，以2.5g/L胰蛋白酶消化，分别收集计数并调整细胞密度为4×107/L，接种于96孔培养板，每孔100μl，同时设空白对照组，为200μl无菌PBS，37℃，5%CO2条件下培养，加入5、10、20、30×106U/L含尿激酶的培养基，设10个复孔，分别培养24，48，72，96h，每孔再加入含MTT的DMEM培养基100μl，继续培养4h，吸出孔内液体，加入150μlDMSO，酶标仪OD568nm测定各孔吸光值，绘制细胞生长曲线，以时间为横轴，OD值为纵轴。

2.4观察尿激酶对大鼠肺成纤维细胞的凋亡：流式细胞仪结合PI及Annexin V-FITC双标记染色测定细胞凋亡：取3～5代大鼠肺成纤维细胞，分别加入5、10、20、30×106U/LUK后培养24h，经胰蛋白酶消化后移入离心管，洗涤、离心，弃上清，加入buffer溶液，吹打致密度为4×108/L，取100μl，暗处加入Annexin V和PI各5μl，振荡混匀，室温避光30min上样，用流式细胞仪分析凋亡率。

结　果

1肺FB鉴定结果肺FB经7～10d培养后铺满瓶底，细胞为梭形，呈放射状或栅栏状排列，加入Vimentin一抗及荧光二抗后，从加荧光二抗起，所有操作都在较暗处进行。滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，荧光染色细胞核DAPI染色蓝色，细胞浆波形蛋白阳性表达，即红色(见图1)。

2UK对大鼠肺FB增殖抑制作用加入5、10、20、30×106U/L的UK24h后的OD 568nm较对照组显著降低(P<0.05)，提示UK以时间和剂量依赖方式抑制大鼠成纤维细胞增殖(见图2)。

图1　大鼠肺成纤维细胞波形蛋白免疫荧光染色(×400)

图2尿激酶对大鼠肺成纤维细胞生长曲线[系列1～5：对照组、5×106U/L，10×106U/L，20×106U/L，30×106U/L尿激酶]

3UK对大鼠肺成纤维细胞凋亡的作用流式细胞仪结合PI及Annexin V-FITC双标记染色检测示尿激酶作用大鼠肺成纤维细胞后，可见明显凋亡小体或凋亡细胞。

讨　论

肺纤维化是由多种病因引起的慢性肺泡间质性炎症，肺泡结构进行性损害，细胞外基质及胶原沉积为特征的疾病。肺纤维化晚期为肺间质纤维化和蜂窝肺[3]。肺成纤维细胞是肺纤维化发生、发展过程中起关键作用的细胞，肺纤维化发病可能与成纤维细胞过度增殖、不能及时凋亡有关[4]，成纤维细胞凋亡减少可能导致持续的修复过程失调引发纤维化[5]。

尿激酶在体外能抑制细胞外基质中胶原合成，起到抗纤维化的作用。UPA参与血管新生，基质重构、ECM降解，与肺纤维化密切相关[6]。肺纤维化时UPA与PAI-1表达失衡，UPA下降，其抑制剂PAI-1增加，增加UPA可减降低肺纤维化程度。

本研究中鉴定成纤维细胞免疫荧光实验，细胞浆波形蛋白阳性表达(即红色)，证实为成纤维细胞。本研究发现：MTT比色法观察到UK对肺纤维化大鼠肺成纤维细胞作用24～96h，不同浓度尿激酶组OD568nm值均低于对照组，显示UK以时间和剂量依赖方式抑制细胞增殖；流式细胞仪结合PI及AnnexinV-FITC双标记染色检测可见B2、B4区可见凋亡细胞，证明UK抑制大鼠肺成纤维细胞增殖与细胞凋亡有关。

实验表明：尿激酶抑制大鼠肺成纤维细胞增殖通过诱导成纤维细胞凋亡发生。促进肺损伤过程中成纤维细胞的及时凋亡有望成为治疗肺纤维化的有力措施。

[1]Jordan RC,Erin EM.Recent evidence for pharmacological treatment of idiopathic pulmonary fibrosis[J].Annals of Pharmacotherapy，2014，48(12)：1611-1619.

[2]刘延梅,马少君,苗 青,等.川穹嗪联合胚胎干细胞治疗大鼠肺纤维化的机制研究[J].陕西医学杂志,2014,43(1):10-14.

[3]Noble PW,Barkauskas CE,Jiang D.Pulmonary fibrosis ：patterns and perpetrators[J].J Clin Invest, 2012,122(8):2756-2762.

[4]Nho RS,Peterson M,Hergert P,etal.FoxO3a (Forkhead Box O3a) deficiency protects idiopathic pulmonary fibrosis(IPF) fibroblasts from type I polymerized collagen matrix-induced apoptosis via caveolin-1 (cav-1) and fas[J]. PLoS One，2013,8(4):e61017.

[5]张效云,李琦.细胞自噬与肺纤维化[J].生理科学进展,2015,46(4):314-316.

[6]张纾难,贾明月,于 洋.近5年中医呼吸病学术发展述评[J].世界中医药，2014，9(8)：969-973.

(收稿：2016-03-20)

Effect of urokinase on apoptosis of pulmonary fibroblasts in rats

Department of Respiratory Medicine,Xi’an Central Hospital (Xi’an710003)

Shao JingyunLiuAnDu Xushenget al

Objective: To study the effect of urokinase on apoptosis of pulmonary fibroblasts in rats.Methods:Five SD male rats were modeled pulmonary fibrosis modelling by endotracheal perfusion bleomycin.Pulmonary fibroblasts in the model group were cultured with urokinase of different concentrations for 24～96 hours. Cell apoptosis was examined by flow cytometry.Results:Urokinase inhibited pulmonary fibroblasts in time and concentration dependent manners.Apoptosis bodies were found by flow cytometry.Conclusion: Urokinase can inhibit the proliferation of fibroblast，which isrelated to cell apoptosis.

Fibroblasts/drug effectiveLungApoptosisBleomycin/ chemically inducedUrokinase/therapeutic useModel,animalRats

西安交通大学第一附属医院呼吸科

R563

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.09.002

*陕西省科技研究发展计划(2014KCT-23)

陕西省西安市科技计划项目[SF1316(1)]