高效液相色谱法同时测定太白贝母与暗紫贝母中9种核苷类成分的含量

游静，张德全，潘兴娇，张华，周浓,*，俞姣姣，王雅正

1(重庆三峡学院 生命科学与工程学院，重庆，404000) 2(大理大学 药学与化学学院，大理，671000)



高效液相色谱法同时测定太白贝母与暗紫贝母中9种核苷类成分的含量

游静1，张德全2，潘兴娇2，张华1，周浓1,2*，俞姣姣1，王雅正1

1(重庆三峡学院 生命科学与工程学院，重庆，404000) 2(大理大学 药学与化学学院，大理，671000)

建立太白贝母和暗紫贝母中9种核苷类成分(尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷、2′-脱氧腺苷)的高效液相色谱法(HPLC)分析方法，并对核苷类的含量进行比较。采用VenusilMPC18(2)(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，甲醇-水为流动相，梯度洗脱，流速1.0mL/min，柱温35 ℃，检测波长260nm为分析条件。在设定的试验条件下，9种核苷在30min内实现了良好的分析，待测核苷成分在各自线性范围内，峰面积积分值与进样量质量浓度呈良好的线性关系(r= 0. 999 0～0. 999 9)，平均回收率为96.68 %～101.35 %(RSD<3%)。结果表明：不同品种及同一品种不同商品名称的太白贝母和暗紫贝母中均含有9种核苷类成分，但含量上均存在差异，其中尿苷、鸟苷和腺苷含量较高，而尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸苷、2′-脱氧腺苷含量较低。松贝中核苷类成分的含量略低于青贝。太白贝母中胞苷、尿苷、鸟苷、胸苷、腺苷、2′-脱氧腺苷及其总含量整体上呈现出随着生长年限(花生大贝、花生小贝>大尖、中尖、小尖>松尖)增加而含量降低趋势，但尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤含量呈现出随着生长年限增加而增加的趋势。从整体上看，太白贝母中核苷类成分的含量高于暗紫贝母，具有化学等同性，2种基源的川贝母作为同一药材使用是可行的。

太白贝母；暗紫贝母；高效液相色谱法；核苷；商品规格；同时测定

川贝母为百合科植物太白贝母(Fritillaria taipaiensisP.Y.Li)、暗紫贝母(Fritillaria unibracteataHsiaoetK.C.Hsia)等贝母属植物的干燥鳞茎，为驰名中外的药材，有着悠久的应用历史，为润肺止咳的要药，疗效显著[1-2]。据统计，以川贝母为原料生产的中成药多达200种以上[3]，同时，常用于清咽润喉和糖尿病类的保健食品配方中[4]。因此，川贝母在疾病治疗或日常食疗中扮演着日益重要的角色，与人民健康密切相关。

据文献记载，太白贝母与暗紫贝母中主要含生物碱、皂苷、核苷、多糖等[2]，其中水溶性成分主要是核苷类成分[5-6]。研究表明，暗紫贝母等祛痰有效成分主要集中在其水提物中[7]，而川贝母的传统用药方法主要是水煎剂[5-6]，因此，对川贝母水溶性成分的研究具有重要意义。目前，针对太白贝母和暗紫贝母中核苷类含量的检测报道较多[5-6, 8-9]，但太白贝母和暗紫贝母核苷类含量的检测与比较文献很少。

本试验采用高效液相色谱法分别测定太白贝母和暗紫贝母的核苷类含量，并对它们的核苷类化合物进行了含量分析及种类差异的相关性研究。

1　材料与方法

1.1仪器与设备

LC-20A型高效液相色谱仪，日本岛津集团；DZF-6050MBE型电热恒温真空干燥箱，上海博讯实业有限公司；SB-5200DTN型超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；TDZ5-WS型多管架自动平衡离心机，湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司；CP225D型分析天平，德国Sartorius公司。

1.2材料与试剂

太白贝母于2011年7月采自重庆市巫溪县兰英乡太白贝母种植基地，经重庆三峡学院生命科学与工程学院周浓副教授鉴定为百合科植物太白贝母F. taipaiensis的干燥鳞茎，根据不同生长年限而药材形状和大小分为6个商品名称，分别称作松尖、小尖、中尖、大尖、花生小贝和花生大贝。暗紫贝母于2011年6月采自四川省松潘县，经重庆三峡学院生命科学与工程学院周浓副教授鉴定为百合科植物暗紫贝母F. unibracteata的干燥鳞茎，根据形态特征不同分为松贝、青贝(见表4)，留样凭证存放于重庆三峡学院生物与食品基础实验教学中心。

尿嘧啶、鸟嘌呤、尿苷、腺嘌呤、胸苷和腺苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号分别为：100469-200401、140631-201205、110887-200202、886-200001、101215-201401、110879-200202)，胞苷、鸟苷、2′-脱氧腺苷对照品(南京都莱生物技术有限公司，纯度经HPLC峰面积归一化法计算大于98%)。甲醇色谱纯为美国Fisher公司，水为娃哈哈牌纯净水。

1.3色谱条件

色谱柱为VenusilMPC18(2)柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为A相为甲醇，B相为水，梯度洗脱(0min→10min→15min→20min→30min，1%A→5%A→15%A→20%A→30%A)；检测波长为260nm；体积流量为1.0mL/min；进样量为20μL；柱温为35 ℃。

1.4对照品溶液的制备

分别精密称取减压干燥至恒重的尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷、2′-脱氧腺苷对照品适量，加纯净水溶解并制成质量浓度分别为107.8、105.7、102.8、105.9、107.0、317.4、105.2、882.0、106.1μg/mL的对照品贮备液。

1.5供试品溶液的制备

精密称取样品粉末(过3号筛)1.0g，置50mL具塞锥形瓶中，精密加蒸馏水10mL，混匀，室温下超声提取 60min(超声功率300W，工作频率40kHz)，取出，放至室温，摇匀，倒入离心管中，4 000r/min离心10min，过滤，滤渣重复操作1次，合并滤液，以蒸馏水定容至25mL量瓶中，用前4 000r/min离心15min后0. 45μm微孔滤膜过滤，即得试品溶液。

1.6线性关系考察

分别精密吸取1.4项下各对照品贮备溶液适量，以纯净水溶解并稀释制成6个不同质量浓度的系列对照品混合溶液。分别在1.3项下方法进行测定，以各对照品的峰面积积分值(y)与其相应的质量浓度(x)进行线性回归，得回归方程、相关系数和线性范围。

1.7精密度实验

取同一对照品混合溶液，按1.3项下方法连续进样6次，记录各核苷的色谱峰面积，通过计算RSD以考察仪器的精密度。

1.8重复性实验

取太白贝母(S8)和暗紫贝母(S1)样品粉末各6份，每份1.0g，精密称定，按1.5项下方法制备供试品溶液，按1.3项下方法进行测定，记录各核苷的色谱峰面积，通过计算RSD以考察本方法的重复性。

1.9稳定性实验

取同一太白贝母(S8)和暗紫贝母(S1)供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12h按1.3项下方法进行测定，记录各核苷的色谱峰面积，通过计算RSD以考察本样品的稳定性。

1.10加样回收率实验

精密称取已知含量的太白贝母(S8)和暗紫贝母(S1)样品粉末约0.50g，各6 份，分别精密加入各核苷对照品贮备溶液适量，按1.5项下方法制备供试品溶液，验证本方法的准确性，计算加样回收率。

1.11样品含量测定

按1.5项下方法制备8批供试品溶液，按1.3项下方法进行测定，测定其9种核苷类成分的含量。

2　结果与分析

2.1样品的HPLC色谱测定结果

太白贝母、暗紫贝母样品及9种混合对照品分离的HPLC色谱图(图1)。结果显示，在1.3项下色谱条件下25min左右样品中核苷和碱基可被全部洗脱，9种核苷和碱基能在30min有效分离，且峰形良好，杂质干扰少，因此该流动相是可行的。同时，太白贝母和暗紫贝母的HPLC图整体上具有一定的相似性，进一步说明不同川贝母品种在该流动相下存在各核苷类成分量比关系的不同，但还存在自身的特征峰。

1-尿嘧啶；2- 胞苷；3- 鸟嘌呤；4- 尿苷；5- 腺嘌呤；6- 鸟苷；7- 胸苷；8- 腺苷；9- 2′-脱氧腺苷图1　混合对照品(A)、太白贝母(B)、暗紫贝母(C)HPLC色谱图Fig.1　The Chromatograms of Standand (A), Fritillaria taipaiensis(B)and Fritillaria unibracteata(C)

2.2线性关系考察的结果

9种核苷类成分标准曲线的回归方程见表1，相关系数r均大于0. 999 0，说明峰面积与核苷含量之间具有显著的线性相关性。

2.3精密度试验

尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷、2′-脱氧腺苷RSD分别为0.43 %、0.53 %、0.76 %、0.79 %、1.91 %、0.92 %、1.15 %、1.27 %、1.64 %，说明检测仪器检测时精密度良好。

表1　9种核苷成分的线性关系和范围

2.4重复性试验

太白贝母(S8)中尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷、2′-脱氧腺苷的含量分别为22.599 1、10.599 8、15.397 9、123.011 5、10.247 4、94.558 2、7.307 2、143.146 1、10.753 3μg/g，RSD分别为2.54 %、1.25 %、1.45 %、1.81 %、1.02 %、2.63 %、1.85 %、2.73 %、1.79 %；暗紫贝母(S1)中尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷、2′-脱氧腺苷的含量分别为8.752 9、20.659 8、3.304 6、71.527 1、6.208 6、62.144 0、25.651 1、84.612 7、30.367 0μg/g，RSD分别为1.68 %、2.01 %、2.12 %、1.69 %、0.92 %、1.94 %、2.65 %、1.57 %、2.78 %，表明本方法的重复性较好。

2.5稳定性试验

太白贝母(S8)中尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷、2′-脱氧腺苷色谱峰面积的RSD分别为2.57 %、2.24 %、0.39 %、2.01 %、2.20 %、0.99 %、2.82 %、2.68 %、2.48 %；暗紫贝母(S1)中尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷、2′-脱氧腺苷色谱峰面积RSD分别为2.81 %、1.89 %、1.28 %、1.06 %、2.93 %、0.62 %、1.98 %、2.10 %、2.54 %，说明样品溶液至少在12h内稳定。

2.6加样回收率实验

太白贝母(S8)中9种核苷的平均回收率在97.16 %～101.35 %，RSD1.01 %～2.77 %，符合分析要求，结果见表2。暗紫贝母(S1)中9种核苷的平均回收率在96.68 %～100.73 %，RSD1.44 %～2.56 %，符合分析要求，结果见表3。表明上述实验方法的准确度较高，能应用于川贝母中核苷和碱基类活性成分的检测与分析。

表2　加样回收率实验结果(n=6)

续表2

化合物本底值/μg加标量/μg测定值/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%鸟嘌呤7.70207.196014.763198.1397.161.017.69907.196014.589195.757.70057.196014.694197.1961.518163.5400125.9380101.3861.530463.5400122.889196.57尿苷61.542763.5400124.437898.9998.942.1561.530463.5400122.798696.4261.505863.5400125.7431101.1061.518163.5400124.541899.195.12475.350010.362497.905.12575.350010.6377103.035.12685.350010.5546101.46腺嘌呤5.12575.350010.292596.5899.442.395.12375.350010.398698.605.12475.350010.425599.0847.288647.610095.3161100.8847.298047.610096.8379104.05鸟苷47.307547.610096.6858103.71101.192.6047.298047.610093.928997.9447.279147.610094.072698.2947.288647.610095.9698102.253.65434.20807.814898.873.65514.20807.748197.27胸苷3.65584.20807.697196.0497.882.073.65514.20807.806498.653.65364.20807.9017100.953.65434.20807.672195.4871.587470.5600142.3372100.2771.601770.5600145.4248104.62腺苷71.616070.5600142.089699.88101.352.1371.601770.5600143.3776101.7271.573170.5600141.243898.7471.587470.5600144.1815102.885.37775.305010.432395.285.37885.305010.465095.882'-脱氧5.37995.305010.545697.3897.251.48腺苷5.37885.305010.623198.865.37675.305010.546497.455.37775.305010.611598.66

表3　加样回收率实验结果(n=6)

续表3

化合物本底值/μg加标量/μg测定值/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%胞苷10.334010.570020.388295.1298.152.5610.346410.570021.1521102.2310.340210.570020.779198.7610.332010.570020.600897.151.65262.05603.608795.141.65232.05603.676098.43鸟嘌呤1.65302.05603.668198.0197.161.681.65492.05603.633896.251.65402.05603.625195.871.65262.05603.693499.2635.770731.770067.299299.2435.763631.770066.637797.18尿苷35.777931.770067.6782100.4197.621.9335.820831.770066.758497.3835.799331.770066.187395.6535.770731.770066.219195.843.10493.21006.292199.293.10433.21006.189196.10腺嘌呤3.10553.21006.268398.5396.801.743.10933.21006.187795.903.10743.21006.185195.883.10493.21006.158395.1231.078231.740061.758196.6631.072031.740061.367895.45鸟苷31.084431.740062.595999.2896.921.4431.121731.740062.106397.6231.103131.740061.487895.7331.078231.740061.799396.7912.828110.520023.255599.1212.825610.520023.184698.47胸苷12.830710.520022.932096.0298.341.4612.846110.520023.300999.3812.838410.520023.073397.2912.828110.520023.323999.7742.314844.100087.3718102.1742.306444.100086.203599.54腺苷42.323344.100087.8566103.25100.732.2042.374044.100085.296597.3342.348744.100086.364999.8142.314844.100087.4115102.2615.186515.915030.818298.2215.183515.915030.361695.372'-脱氧15.189615.915030.991699.2996.681.77腺苷15.207815.915030.427395.6315.198715.915030.555196.4915.186515.915030.320195.09

2.7样品的含量测定

按标准曲线法定量，分别计算太白贝母和暗紫贝母药材中9种核苷类成分的含量，结果见表4。

结果表明，太白贝母和暗紫贝母中核苷类成分比较相似，均含有尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷、2′-脱氧腺苷，尿苷、鸟苷、腺苷为其主要成分，其含量较高，这与太白贝母[5]、暗紫贝母[6]的水溶性成分的研究结果一致。不同商品规格太白贝母和暗紫贝母样品中核苷类成分的含量具有明显差异，太白贝母栽培品核苷含量相对高于暗紫贝母，这与曹新伟等[9]对川贝母中核苷含量比较的结果相一致，与沈力等[10]对其两者祛痰药效学研究结果基本一致，进一步显示太白贝母栽培品作为扩大川贝母药材资源具有较大的核苷类含量优势。因此，从水溶性活性成分角度来看，2010年版《中国药典》已将太白贝母列为川贝母项下具有一定的科学依据。

由表4还可知，太白贝母中胞苷、尿苷、鸟苷、胸苷、腺苷、2′-脱氧腺苷及其总含量水平整体上呈现出随着生长年限(花生大贝、花生小贝>大尖、中尖、小尖>松尖)增加而减小的趋势，与彭锐[8]、王怀玉[11]等人的研究结果基本一致，说明太白贝母的最适生长与其次生代谢物质合成对生态环境条件的要求有一定的矛盾，导致核苷类含量和产量不能同步增长，表明人工栽培技术在提高太白贝母品质方面尚未成熟。但尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤含量水平整体上呈现出随着生长年限增加而增加的趋势，说明生长年限对太白贝母不同核苷类成分的影响不一致，应根据临床需要确定合理采收年限。同时，松贝中9种核苷及其总含量略低于青贝，提示着松贝作为川贝母药材中的止咳佳品，其发挥药效特色的不仅是核苷类成分。

表4　太白贝母和暗紫贝母中9种核苷类成分的含量(n=3)μg/g

3　结论

(1)本实验采用HPLC法同时检测太白贝母与暗紫贝母中尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷、2′-脱氧腺苷的含量测定方法，并首次测定川贝母中2′-脱氧腺苷的含量，所建立的方法准确性、重复性和稳定性良好，可用于精确测定川贝母中核苷类成分的含量，适用于川贝母药材、饮片及其成方制剂生产过程的质量控制指标，均能起到一定的指导作用。

(2)鉴于核苷类成分显著的生物活性及其在川贝母药材中含量丰富，同时尿苷、鸟苷、腺苷含量较高，提示尿苷、鸟苷、腺苷可作为川贝母质量评价的指标，因此在对川贝母生物碱进行含量测定的同时建立对尿苷、鸟苷、腺苷的定量检测方法能使川贝母的内在质量控制更加全面、更加合理。

(3)通过对同一产地不同商品规格太白贝母与暗紫贝母中核苷类提取物在本试验条件下的定性和定量综合分析评价表明，从水溶性活性成分的角度来看，8批川贝母样品整体活性成分组成相似、药效亦相近，且太白贝母栽培品中核苷类含量均高于暗紫贝母野生品。因此，从核苷类活性成分来讲，现已将太白贝母作为川贝母新的基源植物，具有一定的科学依据和良好的开发前景，川贝母资源匮乏问题有望能得到一定程度的缓解。

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Simultaneousdeterminationofninenucleosidescontentsusinghigh

performanceliquidchromatographyinFritillaria taipaiensisP.Y.LiandFritillaria unibracteataHsiaoetK.C.Hsia

YOUJing1,ZHANGDe-quan2,PANXing-jiao2,ZHANGHua2,ZHOUNong1,2*,YUJiao-jiao1,WANGYa-zheng1

1(CollegeofLifeScienceandEngineering,ChongqingThreeGorgesUniversity,Chongqing404000,China) 2(CollegeofPharmacyandChemistry,DaliUniversity,Dali671000,China)

Anewhighperformanceliquidchromatography(HPLC)methodforanalyzingninenucleosides(uracil,cytosine,guanine,uridine,adenine,guanosine,thymidine,adenosine,and2'-deoxyadenosine)wasestablishandthecontentsofnucleosideswerecomparedbetweenFritillaria taipaiensisP.Y.LiandFritillaria unibracteatHsiaoetK.C.Hsia.TheVenusilMPC18(2)chromatographiccolumn(4.6mm× 250mm, 5μm)wasused.HPLC-grademethanolandwaterwereusedasmobilephaseAandmobilephaseB,respectively.Theelutionconditionisgradientelutionataflowrateof1.0mL/minusingUVdetectorat260nm.Thetemperatureofcolumnwasmaintainedat35℃.Theresultsshowedthattheseparationeffectofninenucleosideswasgoodwithin30minusingthenewHPLCmethod.Thepeakareavaluesandconcentrationofninenucleosidestestedallshowedagoodlinearrelationship(r=0. 999 0～0. 999 9)withintheirlinearranges.Therecoveryratewas96.68 % ～ 101.35 % (RSD<3%).TheanalysisofnucleosidesinF. taipaiensisandF. unibracteatashowedthattheninenucleosideswasincludedindifferentvarietiesanddifferentcommercialnamesofthesamespecies.However,thecontentsvaried.Thecontentwasthehigherinuridine,guanosineandadenosine,butlowerinuracil,cytosine,guanine,adenine,thymidineand2'-deoxyadenosine.ThecontentofnucleosidesinSongbeiwasslightlylowerthanthatofQingbei.Thecontentofcytidine,uridine,guanosine,thymidine,adenosine, 2'-deoxyadenosineandthetotalnucleosidescontentdecreasedwiththegrowthyear,theorderofthecontentisHuashengdabei,Huashengxiaobei>thatofDajian,Zhongjian,Xiaojian>Songjian.However,thecontentofuracil,guanineandadenineshowedtheincreasingtendencywiththegrowthyear.Overall,thecontentofnucleosidesinF. taipaiensiswashigherthanthatofF. unibracteata.Theyhadtheequivalenceinchemicalcomponet.ItwasfeasiblethatthetwoFritillaria cirrhosawereusedassamemedicalherbs.

Fritillaria taipaiensisP.Y.Li; Fritillaria unibracteataHsiaoetK.C.Hsia;highperformanceliquidchromatography;nucleosides;commercialspecifications;simultaneousdetermination

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601032

学士(周浓为通讯作者，E-mail：erhaizn@126.com)。

重庆市基础与前沿研究计划项目(No.CSTC2013jcyjA10120)；国家自然科学基金项目(No.31200180)资助

2015-05-05，改回日期：2015-07-29