以右旋糖酐发酵废液为原料发酵生产丁二酸

查鑫华，郑璞*，陈鹏程，魏哲

1(江南大学 生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214112) 2(山东金洋药业有限公司，山东 淄博，255100)



以右旋糖酐发酵废液为原料发酵生产丁二酸

查鑫华1，郑璞1*，陈鹏程1，魏哲2

1(江南大学 生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214112) 2(山东金洋药业有限公司，山东 淄博，255100)

以右旋糖酐发酵废液为原料利用琥珀酸放线杆菌发酵生产丁二酸，在比较不同糖浓度废液对发酵产酸影响的基础上，通过Plackett-Burman试验筛选出对摇瓶发酵产丁二酸的主要影响因素 NaH2PO4·2H2O，并用单因素试验确定其最适质量浓度为 2.8 g/L。在3 L发酵罐上进行分批发酵和补料分批发酵，以 60 g/L 初糖质量浓度的右旋糖酐发酵废液为碳源，分批发酵 46.8 h产丁二酸 40.5 g/L；采用30 g/L葡萄糖为起始发酵培养基的碳源，后续补加浓缩右旋糖酐发酵废液的方式进行补料分批发酵，丁二酸质量浓度达到 55.0 g/L，生产强度 1 g/(L·h)，糖酸转化率为 0.83 g/g。结果表明：以右旋糖酐发酵废液为原料发酵生产丁二酸，为解决废液处理排放提供了新途径，具有良好的应用前景。

右旋糖酐发酵废液；培养基优化；补料分批发酵；丁二酸

右旋糖酐发酵废液 (WFBD) 是生物法生产右旋糖酐过程中提取产物之后剩下的发酵液，一般被作为工业废水进行环保处理，但给企业增加额外的环保处理费用。右旋糖酐是一种高分子葡萄糖聚合物，是最早使用和得到公认的一种优良血浆代用品，在医药、食品和石油等方面都有着广泛的应用[1]。右旋糖酐也是世界上第一个工业化生产的微生物多糖，高浓度蔗糖通过肠膜明串珠菌发酵，生成高分子葡萄糖聚合物，再经过精制处理得到不同分子量的右旋糖酐产品[2]。右旋糖酐发酵废液中存在较高浓度的果糖和少量葡萄糖，人们尝试了从发酵废液中提取果糖[3]、发酵生产饲用复合酶制剂[4]、发酵生产衣康酸[5]等方面的研究。

丁二酸是一种重要的 C4平台化合物，目前已广泛应用于食品、医药、农业等领域[6]，在将来还可作为生产可降解塑料聚丁二酸丁二醇酯(PBS)、聚酯多元醇、增塑剂、聚氨酯和原材料型化学产品 1,4-丁二醇的基础材料，应用前景十分广阔[7-8]。琥珀酸放线杆菌具有利用多种碳源(葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖等)发酵生产丁二酸的特性[9]。本文首次报道了利用右旋糖酐发酵废液发酵生产丁二酸，涉及发酵培养基的优化、补料分批发酵工艺，以期为解决右旋糖酐发酵废液的处理提供新途径，实现其废物利用的价值，同时也能进一步降低生物基丁二酸的生产成本。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种

琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes) CCTCC M2012036，由本实验室自主筛选诱变得到，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)[10]。

1.1.2原料

右旋糖酐发酵废液由山东金洋药业有限公司提供，原废液浓缩4倍后葡萄糖 14.9±0.3 g/L，果糖 92.7±0.5 g/L。

1.1.3培养基

种子培养基参见文献[11]。

发酵培养基(除碳源外)参见文献[11]。

1.2方法

1.2.1发酵方法

摇瓶发酵：以右旋糖酐发酵废液为母液，补加发酵培养基中其他成分，配制总还原糖(葡萄糖+果糖)质量浓度60 g/L 的发酵培养基，分装体积25 mL，121℃灭菌20 min，接种量4%(体积分数)，38 ℃下CO2环境中厌氧培养48 h，分析发酵液中糖及有机酸含量。

不同比例葡萄糖与果糖的WFBD组和模拟组的对照试验：WFBD组以右旋糖酐发酵废液为母液，添加外源葡萄糖配制发酵培养基，果糖(g/L)/葡萄糖(g/L)分别设置50∶10、45∶15、40∶20、35∶25和30∶30 五个比例梯度；模拟组中完全不使用右旋糖酐发酵废液，以纯果糖和葡萄糖作为碳源配制发酵培养基，果糖与葡萄糖的比例设置同于WFBD组。

发酵罐分批发酵：装液量1.6 L，接种量10% (体积分数)，温度38 ℃，转速200 r/min，发酵过程中以MgCO3控制pH 6.0～6.5，定时取样，分析发酵液中糖及有机酸含量。

发酵罐补料分批发酵(两种不同补料方式)：①以右旋糖酐发酵废液为碳源配制发酵培养基，初始还原糖质量浓度约50 g/L，随着发酵进行缓慢流加 500 g/L 高质量浓度外源葡萄糖，控制发酵液中葡萄糖质量浓度在 10～15 g/L(A)。②以30 g/L葡萄糖为碳源配制发酵培养基，待发酵液中葡萄糖消耗至10 g/L 左右间歇流加还原糖浓度约300 g/L的浓缩右旋糖酐发酵废液，控制总糖质量浓度在30 g/L以下(B)。

1.2.2Plackett-Burman(PB) 试验设计

使用MINITAB软件设计9因素PB试验[12-14]，原发酵培养基组分浓度作为低水平，高水平选取低水平浓度的1.25倍，培养基配制及发酵方法如1.2.1摇瓶发酵所示，以最终丁二酸产量作为效应值，设计试验次数20次，增加两次中心点试验以利于误差分析，则总试验次数为22次，试验设计如表1所示。

表1　Plackett-Burman试验设计

注：每组数据平行3次，取平均值。

1.2.3分析方法

菌体浓度测量采用比浊法[15]，糖及有机酸的测量采用高效液相色谱法[16]。

2　结果与讨论

2.1不同发酵废液糖浓度对摇瓶发酵产丁二酸的影响

以右旋糖酐发酵废液来配制不同初始糖浓度的发酵培养基，考察发酵废液的糖浓度对丁二酸发酵的影响，结果如表2所示。随着初始糖浓度的增加，菌体OD值、丁二酸产量和糖酸转化率均呈现出先升后降的趋势，当初始糖浓度为60 g/L 时，丁二酸产量为35.3 g/L，糖酸转化率达到最高值0.65 g/g，而当初始糖浓度高于60 g/L 时，糖酸转化率则开始下降，残糖增加，同时菌体OD值也处于下降趋势，这说明高浓度的初糖会抑制琥珀酸放线杆菌的生长及产酸，这与陶生涛[17]用甘蔗渣水解液发酵产丁二酸的结果一致。

表2　不同初始糖浓度对发酵结果的影响

注：每组数据平行3次，取平均值。

2.2以Plackett-Burman 试验优化发酵培养基组分浓度

在确定碳源糖质量浓度为60 g/L时，采用PB试验筛选发酵培养基中主要影响因子，试验设计及效应值丁二酸产量见方法1.2.2，结果处理见表3。

表3　Plackett-Burman试验结果分析

根据以上数据，按各因素的P值大小排序，P值越小其对应因素对效应值影响越大，则原培养基组分中对丁二酸产量影响值由大到小分别排列为：NaH2PO4·2H2O>NaCl>K2HPO4·3H2O>叶酸>玉米浆>无水CaCl2>Na2S>生物素>MgCl2·6 H2O，因NaH2PO4·2H2O的P值(0.306) 远小于其他培养基组分的P值(>0.5)，所以NaH2PO4·2H2O是发酵培养基组分中对丁二酸产量影响的最主要因素，这可能是因为右旋糖酐发酵废液中残留的磷酸盐破坏了原始培养基中磷酸盐缓冲体系的平衡，影响了细胞周围的微环境，最终影响到菌体产酸。

对NaH2PO4·2H2O的浓度作单因素试验，选取2.0～3.0 g/L共6个梯度来优化NaH2PO4·2H2O的浓度，通过比较其菌体浓度、残糖量及丁二酸产量来筛选最优浓度，结果如图1所示。

图1　不同NaH2PO4·2H2O 质量浓度对发酵产丁二酸的影响Fig.1　Effects of various concentration of NaH2PO4·2H2O on succinic acid fermentation

当NaH2PO4·2H2O浓度在2.0～3.0 g/L之间时，菌体浓度的变化不大，即NaH2PO4·2H2O浓度对菌体生长影响比较小；在丁二酸产量方面，当NaH2PO4·2H2O浓度由2.0升高到2.4 g/L 时，丁二酸产量随之升高明显，当NaH2PO4·2H2O浓度高于 2.8 g/L 时丁二酸产量则开始下降，相应的残糖量也随着这个规律而呈现先降后升的趋势。所以最优的NaH2PO4·2H2O浓度为2.8 g/L，该浓度下最利于菌体产酸及充分利用右旋糖酐发酵废液中糖分。

2.3琥珀酸放线杆菌利用葡萄糖与果糖的区别

右旋糖酐发酵废液中只含有果糖和葡萄糖两种糖分，弄清这两种单糖对菌体生长及产酸的区别对提高产量有指导意义。如方法1.2.1中设计不同比例葡萄糖与果糖的WFBD组和模拟组的对照试验，以探究菌体利用葡萄糖与果糖的区别，同时确证右旋糖酐发酵废液中是否有抑制菌体生长及产酸的成分存在，结果如图2所示。

图2　不同比例葡萄糖与果糖对菌体生长及产酸的影响Fig.2　Effects of different proportion of glucose and fructose on cell growth and succinic acid production

在总糖浓度不变的情况下，随着葡萄糖的含量不断升高，菌体浓度和丁二酸产量也在增加，不管是WFBD组还是模拟组都呈现出相同的规律，这说明葡萄糖比果糖更利于被菌体吸收利用，更能促进菌体的生长和产酸过程。另外，分别从菌体的生长和产酸来看，模拟组的发酵结果均优于WFBD组，表明右旋糖酐发酵废液中确实存在抑制菌体生长和产酸的成分。

2.4右旋糖酐发酵废液为碳源分批发酵产丁二酸

在3 L发酵罐中考察以右旋糖酐发酵废液为唯一碳源发酵产丁二酸的情况，从图3可以看出，发酵液中葡萄糖很快被消耗完，当发酵进行至16 h时，菌体OD值达到最大6.18，40 h之后果糖消耗速率和丁二酸产生速率开始急剧下降，至46.8 h 发酵结束时发酵液中各组分浓度基本不变，最终产丁二酸40.5 g/L，果糖残余量较高，整个发酵过程总耗糖速率为1.01g/L，丁二酸生产强度为0.87 g/L/h，糖酸转化率为0.83 g/g。刘璇[11]等以葡萄糖为碳源进行分批发酵时，以50 g/L 葡萄糖为底物发酵32 h产丁二酸40.7 g/L，生产强度1.27 g/(L·h)，糖酸转化率0.81 g/g，相比较下，以右旋糖酐发酵废液为碳源进行发酵的缺陷在于发酵速率慢，生产强度比以葡萄糖为碳源时低46%，且残糖高，糖利用不彻底。

图3　右旋糖酐发酵废液分批发酵产丁二酸Fig.3　Batch fermentation on waste fermentation broth of dextran forsuccinic acid production

2.5右旋糖酐发酵废液与外源葡萄糖混合补料分批发酵产丁二酸

补料分批发酵可以有效提高丁二酸的产量，2.3的结果显示葡萄糖比果糖更利于菌体的生长及产酸，选择初始发酵用右旋糖酐发酵废液培养基，后续流加葡萄糖(A)和初始发酵用葡萄糖培养基，后续流加浓缩右旋糖酐发酵废液(B)两种补料方式，进行补料分批发酵，见方法1.2.1，其发酵过程如图4所示。

图4　右旋糖酐发酵废液与外源葡萄糖混合补料分批发酵产丁二酸Fig.4　Fed-batch fermentation on waste fermentation broth of dextran and exogenous glucose forsuccinic acid production注：图A为补料方式①发酵曲线，0 h即开始缓慢流加外源葡萄糖，图B为补料方式②发酵曲线，图中箭头处 8h开始间歇流加浓缩 WFBD。

图4A菌体生长略逊于图4B，这可能是由于B中初始发酵液以葡萄糖为唯一碳源，培养基中没有右旋糖酐发酵废液存在，菌体生长未受不明成分影响。两种补料方式发酵液最终的丁二酸质量浓度虽然接近，分别是53.8 g/L 和55.0 g/L，但由于补料方式的不同造成不同的体积稀释效应，实际上B补料方式中生产的丁二酸量更多，具体的参数比较见表4。

从表4数据可以得知，补料方式B残糖浓度低，添加外源葡萄糖量少，单次发酵使用的右旋糖酐发酵废液多，产生的丁二酸量多，且糖酸转化率也更高，说明补料方式B明显优于A，相对于分批发酵，丁二酸产物浓度提高了 35.8%。

2.6不同原料发酵产丁二酸的比较

利用废弃原料是发酵法生产丁二酸的研究热点之一，主要有秸秆、酒糟、甘蔗渣、糖蜜等，如表5所示，与其他废弃原料相比，右旋糖酐发酵废液发酵的丁二酸产量相对较高，且发酵操作简单，无需水解过程，因此是一种具有良好应用前景的原料。

表4　两种补料分批发酵的参数比较

表5　不同原料发酵产丁二酸

3　结论

本文率先报道了以右旋糖酐发酵废液为碳源，利用琥珀酸放线杆菌发酵丁二酸。研究表明：右旋糖酐发酵废液作为碳源对发酵有一定影响，优化发酵培养基中的NaH2PO4·2H2O浓度，摇瓶产丁二酸提高22.3%；以 60 g/L 初糖质量浓度的右旋糖酐发酵废液为碳源进行分批发酵，发酵 46.8 h产丁二酸40.5 g/L，采用发酵起始以低葡萄糖浓度培养基，后续补加浓缩右旋糖酐发酵废液的方式进行补料分批发酵，最终产丁二酸 55.0 g/L，相对于分批发酵提高 35.8%，生产强度 1 g/L/h，糖酸转化率为 0.83 g/g；与其它废弃原料比较，右旋糖酐发酵废液具有不需水解、操作步骤简单的优势，且丁二酸产量相对较高，应用前景良好。

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Fermentative succinic acid production from waste fermentation broth of dextran

ZHA Xin-hua1, ZHENG Pu1*, CHEN Peng-cheng1, WEI Zhe2

1(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology,Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2(Shandong Jinyang Pharmaceutical Company Limited,Zibo 255100,China)

In this paper, succinic acid production by Actinobacillus succinogenes from waste fermentation broth of dextran was studied. After comparing the effect of initial sugar concentrations on succinic acid production, Plackett-Burman experiment was used to determine that NaH2PO4·2H2O was the most important factor in succinic acid production. Results from single factor experiment suggested that the optimal concentration of NaH2PO4·2H2O was 2.8 g/L for the following fermentation tests. Condensed waste fermentation broth of dextran with reducing sugar concentration of 60 g/L was used as the carbon source for batch fermentation in a 3 L fermentor, and 40.5 g/L succinic acid concentration was achieved after 46.8 h. In the fed-batch fermentation, an initial carbon source of 30 g/L glucose solution was added, followed by condensed waste fermentation broth of dextran, leading to an eventual succinic acid concentration of 55.0 g/L with a productivity of 1 g/(L·h) and conversion rate of 0.83 g/g. This work not only provided a new and efficient way to produce succinic acid using cheap raw materials, but also offered a significant promising method for solving the problems of waste liquid emission.

waste fermentation broth of dextran;optimize culture medium;fed-batch fermentation; succinic acid

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601002

硕士研究生(郑璞教授为通讯作者，E-mail: zhengpu @ jiangnan.edu.cn)。

江苏省产学研项目(2015 BY2015019-37)；国家 863支持项目 (2006 AA027235)

2015-09-30，改回日期：2015-10-12