2,3-丁二醇调控四甲基吡嗪及乙偶姻合成菌产物产量的研究

孟武，王瑞明，肖冬光

1(天津科技大学 生物工程学院，天津，300457) 2(齐鲁工业大学 轻工学部，山东 济南，250353)



2,3-丁二醇调控四甲基吡嗪及乙偶姻合成菌产物产量的研究

孟武1,2，王瑞明2，肖冬光1*

1(天津科技大学 生物工程学院，天津，300457) 2(齐鲁工业大学 轻工学部，山东 济南，250353)

发酵初期在枯草芽孢杆菌发酵培养基中添加2,3-丁二醇(2,3-BD)可以调控发酵产物乙偶姻，四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine,TTMP)的产量。随着2,3-BD添加量的增加，所产乙偶姻和TTMP的量随之增加，当2,3-BD的添加量≥4.0 g/L时，乙偶姻和TTMP的产量不再增加。同时，枯草芽孢杆菌的生物量、糖转化率也随之变化。该调控方法对枯草芽孢杆菌的分子改造菌株(ΔbdhA)调控产乙偶姻和TTMP的产量影响不大。

四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine,TTMP)；乙偶姻；产量；枯草芽孢杆菌；调控

吡嗪类化合物是一类含有1,4-二氮杂苯母环的化合物总称，具有似牛肉加热时的香味、果仁及可可香味，稀释至300 mg/kg时呈巧克力香味，在茅台酒及芝麻香型白酒中大量存在，是白酒香气的主要组分[1]。此外，四甲基吡嗪(TTMP)是一种对人体有益的物质，可以降血压，并在医药合成中被广泛应用[2-3]。乙偶姻通常情况下可添加于食品中，增加食品的香气，是一种天然的食品添加剂[4]，在医药行业，乙偶姻由于具有不同的构型可以用来合成稀有药物及作为药物中间体，另外，它在烟草[5]、塑料、化学及涂料工业上都有广泛的应用[6]。

目前，在白酒行业中尚未对吡嗪类化合物的研究引起足够重视，并且吡嗪类化合物的代谢途径及调控机理尚不明确。白酒业的科研人员最初认为，吡嗪是由美拉德反应生成的[7]，后来发现蛋白质加热分解途径、氨基酸类加热分解途径、微生物代谢产物途径也能产生吡嗪类化合物。江南大学首次证实了中国白酒中TTMP并非美拉德途径所产生，确定了白酒中TTMP的产生机制[8]，并在“中国白酒169 计划”中对相关研究结果进行了阐述，包括产生TTMP的微生物(枯草芽孢杆菌)、产生途径及代谢调控，其TTMP的生产能力达到了国际领先水平，并将相关技术应用到了酿酒企业，明显提高了TTMP的含量。

酿酒中产生吡嗪类化合物多以细菌发酵为主，尤其以芽孢杆菌类菌株中的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌为主[9-10]。由于酿酒中产生吡嗪类化合物的合成机理尚不清确，吡嗪的种类及其对酒的风味及功能贡献尚不明确，目前关于微生物发酵法生产乙偶姻的研究报道较少，且产量较低。刘建军等获得1株产乙偶姻的枯草芽孢杆菌，以葡萄糖为碳源，得到16.3 g/L的乙偶姻[11]。因此，研究TTMP和乙偶姻的代谢途径与调控机制来提高其产量具有较大的实用价值。

以目前的研究水平，很难通过底物添加来调控提高TTMP和乙偶姻的产量。已有报道，通过补料和内源策略[12-13]、筛选基因突变株[14]等方法的研究，观察其对TTMP和乙偶姻发酵产量以及减少副产物浓度的影响。本实验中，通过在发酵前期添加2,3-丁二醇(2,3-BD)进行发酵调控实验，研究对枯草芽孢杆菌TTMP和乙偶姻发酵产量的影响，从而以最低成本来提高所产TTMP和乙偶姻的量。主要考察了发酵初期添加2,3-BD对枯草芽孢杆菌的TTMP和乙偶姻发酵产量的影响，同时，结合2,3-BD调控对该菌株的基因改造菌株(ΔbdhA)的目的产物影响实验，研究分析2,3-BD调控提高目的产物的效果及基本机理。

1　材料与方法

1.1菌种

枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisBS2)，由齐鲁工业大学轻工学部王瑞明教授提供。

TTMP高产基因工程菌枯草芽孢杆菌B.subtilisBSA (ΔbdhA)，由天津科技大学对B.subtilisBS2分子改造获得。

1.2培养基及发酵培养方法

培养基：Luria-Bertani (LB培养基)；YPG培养基(参照文献[15])。

种子培养方法：在无菌条件下，用接种环取一环活化好的斜面菌种接种到装有50 mL LB培养基的250 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min摇床振荡培养12 h。然后按接种量2%(体积分数)接到装有50 mL含10 g/L葡萄糖的LB培养基的250 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min摇床振荡培养12 h，调整菌体生长量OD600值为0.05，作为种子。

发酵培养方法：将种子液按4%体积分数的接种量接种到装有200 mL含70 g/L葡萄糖的YPG培养基的500 mL三角瓶中，37 ℃，200 r/min振荡培养8 d，期间每12 h补加5 mL质量浓度为1 mg/mL的葡萄糖溶液。

添加2,3-BD调控实验，在发酵初期向培养基加入分别为：1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 g/L梯度质量浓度的2,3-BD，定时取样分析产物产量、生物量变化情况。

1.3分析方法

HPLC色谱柱，Bio-Rad HPX 87H用于对产物进行分离，测定残余葡萄糖的浓度。顶空固相微萃取(HS-SPME)和氮磷检测器(GC-6890 NPD)，分离并测定乙偶姻和TTMP的浓度。色谱柱为HP-INNOWax: 30 m×250 μm×0.25 μm，气相色谱分析测定

2,3-BD的浓度。细胞生长量的测定：用紫外分光光度计对细胞生长的OD600值进行监测。

2　结果与分析

2.1培养条件对枯草芽孢杆菌产乙偶姻的影响

2.1.1pH对枯草芽孢杆菌产乙偶姻的影响

B.subtilisBS2的细胞生长量、TTMP和乙偶姻的发酵产量受pH的影响。在pH分别为6.5，7.0，7.5，8.0，8.5的条件下进行发酵。当pH控制在7.5时，B.subtilisBS2的OD600值最高，为12.16，结果如图1；乙偶姻的合成在144 h达最高产量11.28 g/L，而后下降。当pH低于或高于7.5时，B.subtilisBS2的OD600值都低于10.38，乙偶姻的产量也在pH为7.5时达到最高值，结果如表1。

图1　不同pH发酵条件对B.subtilis BS2菌体细胞生长的影响Fig.1　Effect of different pH control on the cell growth of B.subtilis BS2(数据是3组实验平均值及标准偏差)

pH值时间a/h乙偶姻产量/(g·L-1)时间b/hTTMP产量/(g·L-1)OD600max6.5144.27.13±0.03168.215.15±0.089.52±0.017.0144.79.38±0.04168.718.56±0.1210.27±0.047.5144.311.28±0.04168.321.84±0.4012.16±0.078.0144.410.25±0.03168.419.27±0.1110.38±0.068.5155.99.16±0.05168.917.87±0.099.73±0.05

注：a从接种到乙偶姻产量达到最高时的发酵时间；b从接种到TTMP产量达到最高时的发酵时间。数据是3组实验的平均值和标准偏差。

2.1.2添加2,3-BD对枯草芽孢杆菌产乙偶姻的影响

在发酵初期向培养基加入梯度质量浓度的2,3-BD：1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 g/L，HPX 87H色谱柱检测分析产物和碳源底物消耗变化量，HS-SPME联合GC-6890 NPD分别检测产物乙偶姻和TTMP含量变化量，如表2。随着2,3-BD添加量由1.0 g/L增加到3.0 g/L，B.subtilisBS2产乙偶姻的最高产量由11.28 g/L提高到15.4 g/L。乙偶姻的合成受添加2,3-BD的影响，当培养基中2,3-BD的添加量提高到3.0 g/L以上时，发酵产物乙偶姻的产量不再增加并且随着2,3-BD添加量的增加有所减少。同时，随着添加2,3-BD量的增加，细胞生长略受影响。2,3-BD的添加，可以提高乙偶姻的产量和菌体细胞生长量，在添加量为3.0 g/L时OD600达到最大值为17.72，葡萄糖利用率随着2,3-BD的添加也略有提高，见表2，图2。综合考虑发酵时间以及2,3-BD添加量、产物量，可见，2,3-BD调控B.subtilisBS2发酵产物，最佳添加量为3.0 g/L，可以得到15.4 g/L的乙偶姻最大产量。添加2,3-BD调控乙偶姻的产量，针对草芽孢杆菌的发酵生产是有效可行的。

图2　添加2,3-BD调控(实心)对B.subtilis 的影响Fig.2　Effect of addition of 2,3-BD on the cell growth, 2,3-BD production and glucose specific uptake rate(residual glucose)by B.subtilis BS2. Product proles of BS2 (Open) and BS2 with addition of 3 g/L 2,3-BD (lled symbols) are shown (数据是三组实验平均值及标准偏差)

2.2添加2,3-丁二醇对枯草芽孢杆菌产TTMP的影响

TTMP发酵产量同样受pH的影响。当pH控制在7.5时，TTMP的合成在168 h左右达最高产量21.84 g/L，当pH低于或高于7.5时，TTMP的产量都低于此值，结果如表1。分析产物表明，添加2,3-BD对提高B.subtilisBS2产TTMP有较明显的效果，并且2,3-BD添加量对TTMP和乙偶姻的产量影响有一致性，如表2。随着2,3-BD添加量由1.0 g/L增加到3.0 g/L，B.subtilisBS2产TTMP的最高产量由21.84 g/L提高到29.65 g/L，当2,3-BD的添加量大于3 g/L时，发酵产物TTMP的产量不再增加并且随着2,3-BD添加量的增加有所减少。总体上，添加2,3-BD调控TTMP和乙偶姻的产量影响有一致性，针对草芽孢杆菌的发酵生产是有效可行的。

表2　2,3-BD调控对B.subtilis BS2产物乙偶姻和TTMP的影响

注：a从接种到乙偶姻产量达到最高时的发酵时间；b从接种到TTMP产量达到最高时的发酵时间。数据是3组实验的平均值和标准偏差。

2.3测定结果与分析

基因工程菌株枯草芽孢杆菌B.subtilisBSA (ΔbdhA)，此菌体以葡萄糖为碳源合成乙偶姻和TTMP的主要发酵产物，与以上2,3-BD调控同理，以2,3-BD调控提高TTMP和乙偶姻的发酵产量。检测B.subtilisBSA (ΔbdhA)的发酵产物乙偶姻，TTMP产量、菌体生长量，结果如表3。添加2,3-BD对提高该菌的乙偶姻和TTMP的产量没有明显效果，随着2,3-BD添加量的增加，乙偶姻和TTMP的产量值有所浮动，但变化较小，同时对菌体细胞生长量略有提高的作用。

表3　2,3-BD调控对B.subtilis BSA (ΔbdhA)产物乙偶姻和TTMP的影响

注：a从接种到乙偶姻产量达到最高时的发酵时间；b从接种到TTMP产量达到最高时的发酵时间。数据是3组实验的平均值和标准偏差。

3　讨论

对比不同培养基的pH值对B.subtilisBS2产乙偶姻及TTMP量的影响，B.subtilisBS2的最适pH值是7.5左右。因为培养基的pH值主要影响菌体细胞膜表面带电基团的解离及其微观结构，引起细胞膜两侧质子动力的变化，进而影响营养物质的吸收及代谢物的分泌，从而导致乙偶姻及TTMP的产量都相对较高，菌体的细胞生长量也较高。

发酵初期添加2,3-BD调控B.subtilisBS2产乙偶姻及TTMP量实验得出，该调控方法对该菌效果明显。2,3-BD调控能提高B.subtilisBS2的乙偶姻和TTMP产量，以及菌体细胞生长量，其最佳添加量为3.0 g/L，但是对调控B.subtilisBSA (ΔbdhA)的乙偶姻及TTMP产量没有明显效果。发酵初期添加2,3-BD有利于这两种菌的菌体生长，当添加量大于3.0 g/L时，乙偶姻及TTMP产量都有所降低。但总体评价，2,3-BD调控方法提高枯草芽孢杆菌发酵产乙偶姻及TTMP量是具有成本效益的。

实验结果表明，发酵初期添加少量2,3-BD可以提高TTMP和乙偶姻的发酵产量，但具体机理尚不明晰。推测由于乙偶姻和2,3-BD的转化之间是可逆的，两者通过2,3-丁二醇脱氢酶又名3-羟基丁酮还原酶(由bdhA基因转录生成)催化合成，乙偶姻又作为前体合成TTMP，如图3所示。

图3　葡萄糖在枯草芽孢杆菌中生成乙偶姻和TTMP的代谢途径Fig.3　The acetoin and TTMP biosynthetic pathways from glucose in B. subtilis BSA (ΔbdhA)

发酵初期加入2,3-BD，首先能够起到反馈抑制的作用，同时2,3-丁二醇脱氢酶是可逆的，能够促进乙偶姻的生成和积累，进而提高TTMP的产量。另外，有文献报道，在培养基中缺乏碳源的条件下，2,3-BD能够继续充当碳源生成乙偶姻[16]，利于乙偶姻的合成和积累，从而促进TTMP的合成。从诱导调控效果看，此方法对提高基因工程菌株枯草芽孢杆菌B.subtilisBSA (ΔbdhA)的乙偶姻及TTMP产量没有明显效果，分析可能是由于该菌为敲除基因bdhA的分子改造菌，如图3所示，从而消除了乙偶姻跟2,3-BD的可逆合成，不能促进乙偶姻的生成和积累，进而也不能提高TTMP的产量，为2,3-BD调控的机理研究提供了一定依据。发酵初期添加2,3-BD调控提高枯草芽孢杆菌产乙偶姻和TTMP产量的具体机理还需要酶的结构功能以及代谢途径做进一步研究。

[1]康文怀,徐岩.中国白酒中风味分析及其影响机制的研究[J].北京工商大学学报,2012，30(3)：53-58．

[2]吴建峰.中国白酒中健康功能性成分四甲基吡嗪的研究[J].酿酒科技,2007,23(1):117-120．

[3]杨涛,李国友，吴林蔚,等.中国白酒健康因子的研究及其生产菌选育和在生产中的应用(I)[J].酿酒科技,2010,36(12):65-69．

[4]胡明一,王中.食用香料乙偶姻[J].精细与专用化学品,2002,18(1):20-21．

[5]常爱霞,贾兴华，郝廷亮,等.特香型烤烟挥发性致香物质的测定与分析[J].中国烟草科学,2002，25(1):1-5．

[6]朱卓越,黄淑芳,杨华武,等.溴酸钠氧化制乙偶姻[J].香料香精化妆品,2009,18(4):11-13．

[7]崔利.酱香型白酒中吡嗪类化合物的生成途径及环节[J].酿酒,2007,39(5):39-40．

[8]徐岩,吴群,范文来,等.中国白酒中四甲基吡嗪的微生物产生途径的发现与证实[J].酿酒科技，2011,23(7):37-40．

[9]黄永光,杨国华,张肖克,等.产酱香风味芽孢杆菌类菌株发酵代谢产物及其酶分析研究[J].酿酒科技,2013,31(1):41-45．

[10]张荣.产酱香功能细菌的筛选及其特征风味化合物的研究[D].无锡:江南大学,2009:5-8．

[11]田延军,刘建军,赵祥颖.一株枯草芽孢杆菌在制备3-羟基丁酮中的应用[P].2007．

[12]ZHU Bing-feng,XU Yan.A feeding strategy for tetramethylpyrazine production byBacillussubtilisbased on the stimulating effect of ammonium phosphate[J]. Bioprocess Biosyst Eng,2010,33(7):953-959.

[13]ZHU Bing-feng,XU Yan,et al.High-yield fermentative preparation of tetramethylpyrazine byBacillussp. using an endogenous precursor approach[J].J Ind Microbiol Biotechnol,2010,37(12):179-186.

[14]XIAO Zi-jun,XIE Neng-zi,et al.Tetramethylpyrazine production from glucose by a newly isolatedBacillusmutant[J].Appl Microbiol Biotechnol,2006,73(37):512-518.

[15]丁雪梅,赵树欣.常压室温等离子体诱变选育高产TTMP菌株[J].酿酒科技,2015, http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20150513.1535.012.html．

[16]ZHANG Xian,YANG Tao-wei,LIN Qing,et al.Isolation and identication of an acetoin high production bacterium that can reverse transform 2,3-butanediol to acetoin at the decline phase of fermentation[J]. World J Microbiol Biotechnol,2011,27(12):2 785-2 790.

Effects of cultivation conditions on the yields of acetoin and TTMP

MENG Wu1，2, WANG Rui-ming2, XIAO Dong-guang1*

1(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology, Ministry of Education,Tianjin University of Science and Technology, TEDA, Tianjin 300457, China)2(Key Laboratory of Shandong Microbial Engineering, Qilu University of Technology, Jinan 250353, China)

The effect of cultivation conditions on the yields of TTMP and acetoin compounds produced byBacillussubtiliswere investigated. The yields of TTMP and acetoin were influenced by the supplementation of 2,3-BD to fermentation medium. The yields of TTMP and acetoin were increased with the increasing addition of 2,3-BD until the concentration of supplemented 2,3-BD in matrix reached 4.0 g/L. Meanwhile, the biomass and glucose conversion rate were also changed with the addition of 2,3-BD. Using this method, the supplementation of 2,3-BD showed a little influence on TTMP and acetoin production by abdhAknockout strain ofB.subtilis.

tetramethylpyrazine(TTMP); acetoin; yield;B.subtilis;B.subtilis(ΔbdhA); regulation

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601004

硕士研究生(肖冬光教授为通讯作者，E-mail:xiaoqq@tuet.edu.cn)。

本项目受国家高技术研究发展计划(863计划)(2012AA022108)；山东省科技发展计划(2014GSF121008)

2015-07-24，改回日期：2015-09-14