灵芝酸G诱导Vβ3+CD8+T细胞抗肿瘤活性的研究

余福恒,胡　芳,汪宏良,李仲娟*,李　超,柯萧韵,陈　敏

(1黄石市东方卫生社区服务中心，湖北 黄石 435000;2湖北理工学院 医学院，湖北 黄石 435003)



灵芝酸G诱导Vβ3+CD8+T细胞抗肿瘤活性的研究

余福恒1,胡芳2,汪宏良2,李仲娟2*,李超2,柯萧韵2,陈敏2

(1黄石市东方卫生社区服务中心，湖北 黄石 435000;2湖北理工学院 医学院，湖北 黄石 435003)

为探讨SEA(Staphylococcus Enterotoxin A，SEA)存在下的灵芝酸G(Licochalcone-G，LG)对小鼠CD8+细胞活化及杀伤肿瘤细胞的作用，采用流式细胞技术分别检测CD8+细胞表面分子表达及活化后细胞内的颗粒酶B(Granzyme B，GrB)和穿孔素(Perforin，Pf)的水平、Caspase-3酶的活性分析肿瘤细胞凋亡。结果为:SEA组和SEA+LG组经过3 d刺激能激活小鼠CD8+细胞Vβ3和Vβ11分别为7.4±0.45，11.5±0.72。体外实验显示， SEA组和SEA+LG组的Vβ3+CD8+T细胞内GrB % 的水平分别为70.2±8.04，91.6±8.16;Pf % 的水平分别为67.3±6.86，86.4±7.17，与对照组相比有显著性差异(t=5.24，t=6.43；t=4.31，t=5.47，P<0.01)；SEA组和SEA+LG组的HL-60肿瘤细胞内Caspase-3酶的活性分别为37.6±4.81，68.8±6.82，与对照组相比有显著性差异(t=3.18，t=5.27，P<0.01)；SEA组和SEA+LG组的A20肿瘤细胞内Caspase-3酶的活性分别为23.7±3.58，54.1±5.71，与对照组相比有显著性差异(t=4.23，t=4.88，P<0.01)。SEA依赖的LG能促使小鼠CD8+T细胞Vβ3和Vβ11分子活化，活化的Vβ3+CD8+T细胞内分泌大量的GrB和Pf，并通过Caspase-3的信号途径诱导肿瘤细胞凋亡。

颗粒酶B；灵芝酸G；肿瘤细胞

灵芝酸大多来源灵芝，是一种三萜类化合物[1]。由于分离方法学的限定，灵芝酸的单体成分生产量极少[2-3]，只有极少部分的灵芝酸单体成分的药理作用被广泛研究[4-5]。本次研究样品LG是高效液相色谱法分离出的15种三萜类活性成分之一，希望通过有限的LG样本，来探讨SEA依赖的LG对小鼠CD8+T细胞活化的分子基础及杀细胞的免疫学机理。

1　材料

1.1试药

浓度为20 mg/mL LG由日本灵芝研究所友情提供;SEA、A20细胞和HL-60细胞由日本东京女子医科大学免疫室友情提供;FITC-Caspase3、PKH-26荧光染料、PE-CD8抗体、磁珠抗体和CD8磁珠抗体购自BD公司;酶标板、PRMI-1 640培养粉购自GIBCO公司;Hanks液、胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司;PE-Granzyme B 和FITC-Perforin抗体购自eBiosource公司。

1.2动物

清洁级 C57BL/6纯系小鼠，雄性，8周龄，体重18～22 g(武汉大学实验动物学部提供，许可证号SCXK(鄂)2008-0004)。小鼠随机分为溶剂对照组、SEA组和SEA+LG混合组,每组 10只。实验室饲养1周后，连续腹腔注射蒸馏水、SEA或SEA+LG混合液3 d，收集小鼠脾脏CD8+T细胞进行试验。

2　方法

2.1免疫磁珠法分选小鼠CD8+细胞

取 C57BL/6 小鼠脾脏，玻璃片磨碎200目纱网过滤后溶血，10% FCS PRMI-1 640培养基15 mL离心洗涤3次，0.04%台盼蓝染色计数活细胞；按磁珠抗体试剂盒说明书操作，将107/mL细胞液用10%的PRMI-1 640细胞培养液重悬，加入适量的生物素标记的鸡尾酒抗体(Biotin- Antibody Cocktail包括抗CD4，CD14，CD19，CD123,CD16和TCRγ/δ)混匀，4 ℃孵育 15 min，10%的PRMI-1 640细胞培养液 1 500 r/min离心5 min、洗涤3次后，最终总细胞悬液1 mL置于 Midi MACS分选器中分选[6]，收集CD8+细胞备用。

2.2CD8+T细胞表面亚分子的检测

用4 ℃预冷的 PBS 收集12 孔细胞培养板中的CD8+T细胞，并用冰冷2% 的流式细胞缓冲液(FACS 液)洗涤2 次，加入纯化的鼠IgG 封闭细胞表面 Fc受体，PE标记的抗小鼠CD8单抗和 FITC 标记的抗小鼠Vβ(3.6.11.12)系列单抗同时冰浴30 min 染色， FACS 液洗涤3次，经流式细胞仪进行样本测定，设没有标记的Vβ+CD8+细胞作对照。

2.3CD8+T细胞GrB和Pf的测定

GrB和Pf的测定按说明书进行。简而言之，收集溶剂对照组、SEA组和SEA+LG组刺激3 d的Vβ3+CD8+T细胞用2%的流式细胞液洗涤3次，分别用PE-Granzyme B 和FITC-Perforin抗体进行染色，流式细胞仪测定Vβ3+CD8+T细胞内的GrB和Pf的表达量。

2.4肿瘤细胞内Caspase-3酶的活性检测

取对数期HL-60或A20细胞用10% PRMI-1 640洗涤2次，调整细胞浓度为107个/mL。用红色荧光PKH-26冰浴染色30 min，洗涤3次后分别与Vβ3+CD8+T细胞一起 37 ℃ 5%CO2培养3 h， 收集细胞并用FITC 标记的抗小鼠 Caspase-3抗体染色30 min，流式细胞仪测定HL-60或A20细胞Caspase-3酶的活性。

2.5统计学处理

3　结果

3.1SEA依赖的LG对小鼠体内CD8+T细胞表面Vβ+分子的影响

SEA能与机体内CD8+T 细胞MHC分子架桥活化，通过SEA 或SEA+LG一起诱导CD8+T细胞β链不同结合区域的活性表达[7]。10 μg /mL灵芝酸G、1 μg/mL SEA和他们的混合物溶液连续腹腔注射3 d，收集小鼠脾脏CD8+T细胞，免疫荧光染色后流式细胞仪测定Vβ3、Vβ6、Vβ8、Vβ11和Vβ12的阳性分子表达。不同刺激物对小鼠体内Vβ细胞数量的影响见表1。表1显示，不同刺激物对小鼠体内Vβ6和Vβ8细胞数量的升高无统计学差异(P>0.05)。在后面的实验体系中，为了更加准确评价不同药物对相同群组小鼠的免疫细胞中不同亚分子的作用，Vβ6会作为实验中的阴性对照做进一步研究。SEA和LG混合物与对照组相比，可以显著性升高Vβ3和Vβ11的分子表达(P<0.01)；与SEA组对比，SEA+LG组中Vβ3、Vβ11和Vβ12细胞数量有显著性差异(P<0.01)。

表1　不同刺激物对小鼠体内Vβ细胞数量的影响±s,n=10)

注:与对照组相比较，*P<0.01；SEA+LG与SEA组相比较，◆P<0.01。

3.2SEA依赖的LG对小鼠体内CD8+T细胞分泌GrB和Pf的影响

不同刺激物对VβCD8+T细胞内 GrB和Pf的影响结果见表2。GrB和Pf的分泌是效应T细胞进行细胞免疫的主要途径[8]，通过分析SEA 或SEA+LG一起体外诱导活化的阴性对照Vβ6、阳性活化细胞Vβ3的CD8+T细胞内GrB和Pf水平的变化发现(表2)，Vβ6+细胞经过诱导，细胞内GrB和Pf水平并没有升高；SEA组或SEA+LG组体外诱导Vβ3+CD8+T细胞内GrB和Pf的水平与对照组Vβ6+细胞相比有显著性差异(t=5.24，t=4.31，*P<0.01)；Vβ3+细胞的SEA组与SEA+LG组对比，GrB和Pf的水平均有显著性差异(t=6.43，t=5.47，**P<0.01)。

表2　不同刺激物对VβCD8+T细胞内 GrB和Pf的影响

注:与阴性对照组相比较，*P<0.01；SEA+LG与SEA组相比较，**P<0.01。

3.3 Vβ3+CD8+T细胞对肿瘤细胞杀伤活性的影响

CD8+T细胞内GrB和Pf是机体抗肿瘤免疫的主要方式，CD8+T细胞内GrB和Pf的含量增多，与肿瘤内死亡酶Caspase-3的活性具有高度相关性[9]。不同刺激物对肿瘤细胞死亡的影响结果见表3。表3显示，SEA组与SEA+LG组的Vβ3+CD8+T细胞混合培养3 h，肿瘤细胞HL-60和A20 Caspase-3酶活性与对照组相比有显著性差异(t=3.18，t=4.23，*P<0.01)。SEA组与SEA+LG组对比分析，肿瘤细胞HL-60 和A20 Caspase-3酶活性有显著性差异(t=5.27，t=4.88，**P<0.01)。

表3　不同刺激物对肿瘤细胞死亡的影响( ±s,n=10)

注:与阴性对照组相比较，*P<0.01；SEA+LG与SEA组相比较，**P<0.01。

4　讨论

SEA不仅能与TCR的β链架桥促使T细胞的增殖活化，还可以使活化T细胞分泌细胞因子，是机体免疫应答的重要体现[10]。本次研究是通过SEA依赖的LG对T细胞刺激和诱导，筛选出了SEA依赖的LG对T细胞活化的亚分子Vβ3、Vβ11和Vβ12，而对Vβ6和Vβ8没有活化作用，明确了SEA依赖的LG免疫活化的分子基础。

近年来，灵芝酸A-C和Mf的体内抗肿瘤活性一直被研究和关注[11]。我们的团队也证实了灵芝酸G的抗肿瘤活性与免疫细胞产生的细胞因子有关[12]。本次研究在活化分子Vβ3的基础上，与阴性对照分子Vβ6在细胞毒性上做了进一步对照研究，通过SEA依赖的LG对Vβ3和Vβ6 T细胞的刺激和诱导，体外考察这2类细胞的颗粒酶和穿孔素的活性，与单纯SEA诱导相比有显著性差异(P<0.01)，这说明SEA依赖的LG在抗肿瘤方面的作用是颗粒酶和穿孔素的途径。本实验还通过Vβ3和Vβ6在体外与HL-60和A20肿瘤细胞混合培养3 h后，考察了肿瘤细胞内Caspase-3酶的活性。发现阴性对照细胞Vβ6对肿瘤细胞没有杀伤作用，Vβ3对2种肿瘤细胞均有杀伤作用，与单纯SEA诱导相比有显著性差异(P<0.01)。

本次研究结果揭示SEA依赖的LG能诱导小鼠体内CD8+T细胞亚分子的活化，促使Vβ3 T细胞产生大量的GrB和Pf，诱导肿瘤细胞凋亡。这些结果为LG成为抗肿瘤药物提供了科学的依据。

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(责任编辑吴鸿霞)

Study on Antitumor Activity of Vβ3+CD8+T Cells Induced by Ganoderma Lucidum G

YuFuhen1,HuFang2,WangHongliang2,LiZhongjuan2*,LiChao2,KeXiaoyun2,ChenMin2

(1Huangshi Dong Fang Community Health Service Center,Huangshi Hubei 435000;2School of Medicine,Hubei Polytechnic University,Huangshi Hubei 435003)

Objective： To explore the effect of Staphylococcus Enterotoxin A(SEA) dependent ganoderic acid Licochalcone-G (LG) on CD8+cell activation and killing tumor cells in mouse.Method：The levels of intracellular Granzyme B(GrB) and Perforin (Pf),after surface molecules on CD8+cells were expressed and activated,detected by flow cytometry.Apoptosis of tumor cells was analyzed by the detection of Caspase-3 Enzyme activity.Result：After SEA group and SEA+LG group had been stimulated for 3 days,Vβ3 and Vβ11 of CD8+cells in mouse could be activated,and were 7.4±0.45 and 11.5±0.72 respectively.There were significant difference compared with the control group(t=5.24，t=6.43；t=4.31，t=5.47，P<0.01).GrB activity in HL-60 tumor cells of SEA group and SEA+LG group of were 70.2±8.04 and 91.6±8.16 respectively,and had significant difference compared with the control group(t=5.24，t=6.43，P<0.01) Pf activity in A20 tumor cells of SEA group and SEA+LG group were 67.3±6.86 and 86.4±7.17respectively,and had significant difference compared with the control group(t=4.31，t=5.47，P<0.01).HL-60 Caspase-3 Enzyme activity in tumor cells of SEA group and SEA+LG group were 37.6±4.81 and 68.8±6.82 respectively,and had significant difference compared with the control group(t=3.18，t=5.27，P<0.01).Caspase-3 Enzyme activity in A20 tumor cells of SEA group and SEA+LG group were 23.7±3.58 and 54.1±5.71 respectively,and had significant difference compared with the control group(t=4.23，t=4.88，P<0.01).Conclusion：SEA dependent on LG can prompt Vβ3 and Vβ11 of CD8+cells in mouse to be activated.Large amount of GrB and Pf were excreted in activated Vβ3+CD8+T cells and induced tumor cell apoptosis through Caspase-3 signaling pathway.

Granzyme B；LG；tumor cell

2016-04-23

湖北省科技项目(项目编号:2011Cdc116);黄石市科技项目(黄科农〔2012〕1号);教育部46批留学归国启动资金支持(46-1)。

余福恒,主管技师，本科。

李仲娟，副教授，博士, 研究方向：细胞分子学。

10.3969/j.issn.2095-4565.2016.04.013

R967

A

2095-4565(2016)04-0054-04