紫外诱变及微波辐射对Alternariamali强毒菌株致病力的影响

侯宝宏，窦剑斌，王卫雄，徐秉良

(甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州　730070)



紫外诱变及微波辐射对Alternariamali强毒菌株致病力的影响

侯宝宏，窦剑斌，王卫雄，徐秉良

(甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州730070)

【目的】 减弱苹果斑点落叶病菌AlternariamaliRoberts强毒菌株致病力，以期为有效防治该病害的发生提供理论依据.【方法】 采用紫外及微波辐射两种方法对AlternariamaliRoberts进行诱变，研究其致病力的变化.【结果】 紫外辐射剂量、辐射距离和时长分别为10 W、10 cm、5 min时，可引起A.mali强毒菌株的负突变，致病力减小，6 h后孢子萌发率为58.45 %，4 d后生物学活性显著低于原始菌株(P<0.05)，其中产孢量为2×104个/mL，菌丝生长量为152.67 mg，菌落直径为3.67 cm，7 d后发病率38.50%，病情指数为10.32；微波辐射60 s，A.mali强毒菌株达到最低生物学活性(P<0.05)，6 h后孢子萌发率仅为1.83%，4 d后产孢量为4×104个/mL，菌丝生长量为139.30 mg，菌落直径为3.83 cm，7 d后发病率为31.94%，病情指数仅为7.87.【结论】 紫外辐射可使Alternariamali强毒菌株发生负突变，微波辐射可使Alternariamali强毒菌株致病力减弱.

AlternariamaliRoberts；紫外诱变；微波辐射

由苹果斑点落叶病菌(AlternariamaliRoberts)强毒菌株引起的苹果斑点落叶病是苹果主要病害之一，该病在日本、美国、朝鲜以及伊朗等世界各苹果产区均有发生，在我国黄河故道和渤海湾两大苹果产区发生较为严重[1].A.mali强毒菌株有强致病力，被侵染苹果叶片可形成10～20个病斑于叶片表面，之后病斑处穿孔或破碎，叶片生长受阻减缓，干枯早落，造成树势减弱、产量降低.因此，防治A.mali强毒菌株引起的苹果树斑点落叶病已成为苹果病害的研究热点[2-6].邵旭平等[7]从甘肃省苹果斑点落叶病叶上分离得到致病菌株A.mal强毒菌株和弱毒菌株，并且发现两菌株之间存在交叉保护.目前生产上主要采用化学方法防治该病害，这不仅带来农药残留问题，还会使A.mali产生耐药性[8].所以寻求一种能从根本上减轻该病害发生的方法，一直是广大学者努力的方向.近年来，紫外诱变和微波辐射等方法被应用于植物病害的防治和微生物育种中，此类方法可引起病菌的基因发生突变，使病菌某些机构和功能受到损伤，最终导致病原菌的致病力发生改变.王洲等[9]对枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BS059菌株进行紫外诱变处理，随诱变时长的不同，BS059发生了正突变或负突变.50 s时发生正突变后筛选获得高产α-乙酰乳酸脱羧酶菌株，但诱变时长75 s时产生负突变.刘畅等[10]用紫外线诱变黑曲霉3.2130，筛选获得酸性蛋白酶缺陷的菌株L4.涂璇等[11]采用微波辐射进行了链霉菌702抗药性致死突变的筛选，因此，本试验选用紫外及微波辐射的诱变方法对苹果斑点落叶病菌A.mali强毒菌株进行处理，旨在筛选负突变菌株，并确定能够降低A.mali强毒菌株致病力的诱变方法及其最佳诱变条件，为苹果树早期落叶病高效低毒防治途径提供理论依据.

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1供试菌株AlternariamaliRoberts强毒菌株由甘肃农业大学植物病原学实验室提供.

1.1.2供试培养基PDA培养基：葡萄糖18 g，琼脂12 g，马铃薯200 g，水1 000 mL.

PSK液体培养基：马铃薯200 g，蔗糖20 g，磷酸二氢钾1 g，加水定容到1 L.

1.1.3主要仪器15 W紫外灯、700 W格兰仕T770D20T-TD (W0)型微波炉、磁力搅拌器、孢子振荡器、生化培养箱等.

1.2试验方法

1.2.1A.mali强毒菌株孢子悬浮液的制备将A.mali强毒菌株病原菌接种于PDA培养基上，30 ℃恒温培养4～7 d，用无菌水洗脱PDA平板上的孢子，在显微镜下利用血球计数板将其配制成105个/mL的孢子悬液，4 ℃保存，备用.

1.2.2紫外诱变处理对A.mali强毒菌株的影响将1.2.1中制备的A.mali强毒菌株孢子悬浮液用移液枪吸取200 μL，均匀涂于PDA平板上，置于10 W紫外灯(波长253.7 nm)下 10 cm处分别照射0.5、1、3、5、7、9 min(照射前 30 min打开紫外灯，使光线稳定后开始照射)，照射结束后立即置于加有冰块的自来水中终止反应，然后置于28 ℃暗培养.60 h后，待PDA平板上长出可见的菌落，将其转接至新的PDA平板，25 ℃黑暗培养.

1.2.3微波辐射处理对A.mali强毒菌株的影响吸取1.2.1已制备孢子悬浮液1 mL于灭菌的1.5 mL离心管中并摇匀，在700 W格兰仕T770 D20T-TD (W0)型微波炉中分别辐射处理10、20、30、40、50、60 s.辐射处理后分别吸孢子悬浮液200 μL分别涂于PDA平板上，28 ℃黑暗培养.待60 h后PDA平板上出现可见菌落，将其转接至新的PDA平板，28 ℃黑暗培养.

1.2.4诱变菌株与原始菌株培养性状观察将诱变处理后的菌株和原始菌株的孢子悬浮液分别涂到PDA培养基上，28 ℃暗培养.7 d后分别观察各菌株培养特征和颜色变化，主要包括气生菌丝和基内菌丝颜色及可溶性色素及变化等.

1.2.5诱变菌株产孢量的测定吸取一定浓度的诱变菌株孢子悬浮液(105个/mL)，于 30 mL的 PSK液体培养基中接种后28 ℃振荡培养.4 d后显微计数孢子悬浮液浓度，并计算诱变后菌株产孢量.对照为原始菌株，各处理3次重复.

1.2.6诱变菌株菌丝生长量测定将诱变菌株的孢子悬浮液(105个/mL)，接种于 30 mL的 PSK液体培养基中，28 ℃振荡培养4 d.用灭菌干燥的滤纸过滤后在80 ℃恒温下烘干至恒质量，称菌丝质量并计算干质量.对照为原始菌株，各处理3次重复.

1.2.7菌落生长速率的测定在PDA培养基上活化诱变菌株后打菌饼(直径为6 mm)，并重新接种于PDA平板上(培养皿直径9 cm)于25 ℃黑暗培养，4 d后测量菌落直径并观察菌落形态.以原始菌株作为对照，每个处理重复5次.

1.2.8孢子萌发率的测定孢子萌发试验参照方中达方法进行[12].将诱变菌株孢子稀释成105个/mL，取50 μL涂布于1.5%水琼脂平板，25 ℃黑暗培养6 h，于显微镜下统计孢子萌发率.以原始菌株作为对照，每个处理重复5次.

1.2.9诱变菌株离体致病力测定在低倍镜(10×10)下将诱变菌株制成浓度为每视野10～20个孢子的悬浮液，选取大小及长势相似的新鲜苹果叶片喷雾回接，置于28 ℃，相对湿度为80%条件下观察其发病情况，7 d后测定发病率和病情指数，再次测定病原菌的致病力.设对照为原始菌株，各处理3次重复.

1.2.10诱变菌株稳定性测定将诱变菌株在28 ℃条件下继代培养8代，每 7 d转接1次.观察各代的菌落形态.每个处理重复3次.测定第8代菌

株的产孢量及致病性.以原始菌株作为对照.每个处理重复5次.

2　结果与分析

2.1A.mali强毒菌株的紫外诱变处理

2.1.1紫外诱变后各诱变菌株与出发菌株培养性状的差异A.mali强毒菌株经紫外照射0.5～1 min后，其菌落形态与原始菌株形态无明显差异，菌落气生菌丝茂密，菌落中央墨绿色，具明显的轮纹；而A.mali强毒菌株经紫外照射5～7 min后，菌落中央气生菌丝减少，且菌落颜色变浅，由原始菌的墨绿色变为诱变后的深褐色至褐色(表1).

2.1.2紫外诱变后各诱变菌株的生物学活性A.mali.强毒菌株经不同时间紫外诱变后，其生物学活性与原始菌株相比有较大差异(表2).紫外照射0.5、1、3 min后，诱变菌株的发病率和病情指数均高于原始菌，表明发生了正突变，其致病力增强，而其他各处理致病力减弱，表明发生了负突变.其中紫外处理5 min时，诱变菌株的致病力明显减弱，6 h后的孢子萌发率仅为58.45%.4 d后测定产孢量为2×104个/mL、菌丝生长量为152.67 mg、菌落直径仅有3.67 cm，7 d后发病率及病情指数依次为38.50%和10.32，均与对照差异达显著水平(P<0.05)；而紫外处理0.5 min时，诱变菌株的致病力最强，6 h后的孢子萌发率为93.61%，4 d后产孢量、菌丝生长量、菌落直径分别为6×104个/mL、170.33 mg和4.43 cm，7 d后发病率和病情指数分别为76.05%和23.47%.因此，用10 W紫外灯(紫外波长253.7 nm)于 10 cm处对A.mali强毒菌株照射5 min，可明显降低该菌的致病力.

A：原始菌(CK)；B：紫外诱变0.5 min；C:紫外诱变5 min. 图1　紫外诱变后各诱变菌株与出发菌株菌落形态Fig.1　Colony morphology of the control strain and induced strain after UV mutagenesis表1　紫外诱变后各诱变菌株与原始菌株菌落形态Tab.1　Colony morphology of the control strain and induced strain after UV mutagenesis

处理时间/min7d菌落形态0.5菌落平坦,中央具有气生菌丝较茂密,正面黑色,有明显轮纹1菌落较平坦,表面具有少量白色气生菌丝,有轮纹感,灰黑色3菌落较平坦,生菌丝较少,菌落黑绿色5菌落完整,无气生菌丝,菌落深褐色至褐色,外缘白色7菌落平坦,中央具有少量灰色气生菌丝,菌落深褐色9菌落平坦,气生菌丝较少,菌落灰色至黑色CK菌落平展,中央具较密集气生菌丝,墨绿色菌落,有明显轮纹

表2　紫外诱变后各诱变菌株的生物学活性Tab.2　The biological activities of mutation strains after uv mutagenesis

所有显著性差异比较均在0.05的水平上，相同字母间差异不显著，不同字母间差异显著.

2.2A.mali强毒菌株的微波辐射处理

2.2.1微波辐射后各诱变菌株与原始菌株培养性状的差异A.mali强毒菌株经微波辐射，菌落形态与未照射菌株形态无明显差异，菌落全缘，平坦，中央具有少量白色气生菌丝，菌落墨绿色，有明显的轮纹，正面最边缘为白色，背面为褐色.经微波辐射50～60 s后，菌落较不完整，中央产生少量气生菌丝，颜色变为灰白色至黄褐色(表3).

2.2.2微波辐射后各诱变菌株的生物学活性由表4可以看出，A.mali.强毒菌株经不同时间的微波辐射后，各处理与未处理菌株生物学活性存在较大差异.微波辐射20 s时，诱变菌株的生物学活性最高，致病力最强，6 h的孢子萌发率为75.80%，4 d后产孢量、菌丝生长量、菌落直径分别为11×104个/mL、155.00 mg和4.38 cm，7 d后发病率和病情指数分别为61.19%和14.75，产生了正突变；微波辐射诱变时长为60s时，筛选获得生物学活性最低和致病力最小的诱变菌株.6 h后测定孢子萌发率为1.83%，4 d后测定产孢量为4×104个/mL，菌丝生长量及菌落直径依次为139.30 mg和3.83 cm，7 d后发病率和病情指数分别为31.94%和7.87，与原始菌株相比差异显著(P<0.05).因此，A.mali.强毒菌株经微波辐射60 s后，可以使菌株发生负突变，使其致病力明显减弱.

表3　微波辐射后各诱变菌株与原始菌株菌落形态Tab.3　Colony morphology of the control strain and induced strain after microwave radiation

A：原始菌(CK)；B：微波辐射20 s；C:微波辐射60 s. 图2　微波辐射后各诱变菌株与出发菌株菌落形态Fig.2　The biological activities of mutation strains after microwave radiation表4　微波辐射后各诱变菌株的生物学活性Tab.4　The biological activities of mutation strains after microwave radiation

处理时间/min6h孢子萌发率/%4d产孢量/(个·mL-1)菌丝生长量/mg菌落直径/cm7d发病率/%病情指数1084.93±0.79b6×104±0.54c126.0±2.44e4.3±0.04ab53.33±1.40bc13.58±0.26ab2075.8±0.92c11×104±0.73a155.0±2.69b4.38±0.03ab61.19±1.20a14.75±0.30a3057.08±0.6d9×104±0.84b151.3±3.07b4.03±0.08bc56.66±0.99b13.33±0.33abc407.31±0.09e11×104±0.89a123.0±2.99e4.23±0.01ab46.48±0.89d11.74±0.45cd507.31±0.08e5×104±0.49cd133.3±0.34d4.07±0.03bc46.42±0.89d10.38±0.20d601.83±0.05e4×104±0.55d139.3±0.40c3.83±0.07c31.94±0.70e7.87±0.13eCK93.61±0.95a4×104±0.60d614.0±0.49a4.55±0.04a51.19±0.10c12.56±0.25bc

2.3紫外和微波辐射对A.mali强毒菌株诱变效果的比较

通过对两种方法诱变菌株的形态特征和生物学活性进行比较，结果发现，紫外和微波辐射均可以诱变A.mali强毒菌株，且正突变和负突变都存在(表2，表4).此外，对孢子萌发、产孢量和菌丝生长等生物学指标测定结果进行比较发现，微波辐射后A.mali强毒菌株更易发生诱变，说明A.mali强毒菌株对微波辐射敏感度更高.通过诱变菌株致病性测定，表明紫外诱变5 min后A.mali强毒菌株发病率和病情指数分别低至38.50%和10.32.微波辐射诱变60 s后发病率及病情指数分别低至31.94%和7.87.

2.4诱变菌株的稳定性

诱变菌株的形态学特征和生物学活性的稳定性测定结果表明，诱变后的各菌株在28 ℃进行继代培养8代后，其培养性状和初次培养性状基本一致，其致病力大小也未发生较大改变，说明A.mali强毒菌株经紫外诱变和微波辐射处理后，各诱变菌株具有较好的遗传稳定性.

3　讨论与结论

A.mali强毒菌株经紫外诱变和微波辐射后，在培养性状和生物学活性上发生了一些改变.A.mali.强毒菌株分别经紫外照射5～7 min和微波辐射50～60 s后发生负突变，在PDA平板上菌落变得较不完整，中央气生菌丝减少，颜色变为灰白色至黄褐色，且无轮纹产生.其中分别经紫外处理5 min和微波辐射60 s时，诱变菌株生物学活性最低，致病力显著低于原始菌株(P<0.05).将发生突变的菌株进行继代培养8代后，培养性状和生物学活性未发生较大改变.因此，紫外辐射剂量、照射距离、时长分别为10 cm、10 W、5 min和微波辐射为60 s是两种诱变A.mali强毒菌株减弱其致病力方法中的最佳条件.

紫外诱变和微波辐射可以使病原菌碱基的正常配对受到影响，某些基因发生突变，最终导致病原菌的致病力发生改变.紫外诱变主要是引起DNA分子形成嘧啶二聚体，分子间氢键作用减弱，并扭曲双链结构，使碱基间正常配对受阻，致使造成突变.在诱变过程中，诱变方法是能否诱变成功的最关键的因素之一；此外，为保证突变不恢复，诱变后菌株应在黑暗条件下培养.伏建国[13]利用紫外线诱变链格孢菌筛选强产毒菌株时发现，在初筛的5 000株菌株中，获得152株致病力增强菌株，正突变率为3.0%，得到1 383株致病力减弱菌株，负突变率为27.7%，这与本试验结果有一定的相似性.朱英莲等[14]研究表明，利用紫外诱变照射剂量为15 W、照射距离为22 cm、时间为2 min时，可以筛选出呼吸缺陷型酵母菌株.冯友军等[15]研究表明，对酒精酵母进行紫外诱变，当诱变条件为紫外(灯管功率15 W)波长253.7 nm，辐射间距为21 cm，时长1 min、3 min时，获得了26株呈白色菌落表型的呼吸缺陷型突变株.而在本试验中，紫外诱变的最佳条件为照射剂量10 W、照射距离10 cm、时间为5 min，这与冯友军[15]结果有些差异，可能是由于病原菌本身的特性和紫外灯功率不同所致.叶煦亭等[16]发现细胞膜的通透性可以通过微波辐射增加，所以利用微波辐射筛选出了高产菌株.本试验对A.mali.强毒菌株分别进行紫外诱变及微波辐射，结果发现，经紫外照射5～7 min和微波辐射50～60 s后，在PDA平板上菌落生长不完整，中央气生菌丝减少，颜色变为灰白色至黄褐色，且无轮纹产生；其中经紫外处理5 min和微波辐射60 s时，产生负突变，菌株生物学活性降低，致病力明显减弱.将该菌株继代培养8代后，观察其形态特征并测定生物学特性，结果发现致病力也未发生明显变化.

本试验对A.mali.强毒菌株进行紫外及微波辐射诱变，筛选出了使其发生负突变和致病力明显减弱的最佳条件，并找到A.mali.弱毒菌株.但对于诱变后病原菌的形态是否发生变异，究竟哪些基因发生了突变和哪些机构和功能受到障碍，尚待进一步探索.

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(责任编辑胡文忠)

Effects of ultraviolet lights and microwave irradiation on pathogenicity ofAlternariamali

HOU Bao-hong,DOU Jian-bin,WANG Wei-xiong,XU Bing-liang

(College of Pratacultural Science,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

【Objective】 To study the ways to weak the pathogenicity ofA.malihigh virulence strain,and to provide theory basis for effectively control the disease.【Method】 The high virulence strain ofA.maliwas mutated by ultraviolet lights and microwave irradiation, the variation of pathogenicity were studied.【Result】 Under the doses of ultraviolet mutagenic were power for 10W,irradiation distance for 10 cm and time for 5 min,A.malishowed negative mutation,and pathogenic force decreased,the spore germination rate was only 58.45 % after 6 hours,the quantities of spore production,hypha growth and the colony diameter were 2×104individual/mL,152.67 mg and 3.67 cm respectively after 4 days of incubation,and incidence rate and disease index were 38.50 % and 10.32 after 7 days of incubation.Under the dose of microwave irradiation were power for 700 W and time for 60 seconds,the biological activity ofA.malimutants was the lowest,pathogenicity had the minimum,the spore germination rate was only 1.83% after 6 hours,the quantities of spore production,hypha growth and the colony diameter were 4 ×104individual/mL,139.30 mg and 3.83 cm respectively after 4 days of incubation,and incidence rate and disease index were 31.94 % and 7.87 after 7 d of incubation.【Conclusion】 Ultraviolet lights irradiation could cause the negative mutation,and microwave irradiation could weak the pathogenicity ofA.malihigh virulence strain.

AlternariamaliRoberts;ultraviolet lights; microwave irradiation

侯宝宏(1988-)，女，在读硕士研究生，研究方向为植物病原与植物病害.E-mail:houbh99@163.com

徐秉良，女，教授，博导，研究方向为植物病理学.E-mail:xubl@gsau.edu.cn

国家星火计划项目(2013GA860001)；公益性行业(农业)科研专项(201203034)；甘肃省农牧厅生物技术研究与应用开发项目(GNSW-2012-27).

2015-05-25；

2015-06-30

S 436.611

A

1003-4315(2016)04-0052-06