pH区带逆流色谱结合制备液相分离制备大黄根化学成分△

孙常磊，王召平，孙兆林，耿岩玲，李佳，杨鹏

(1.山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355；2.山东省分析测试中心，山东 济南 250014；3.济南三峰生物工程有限责任公司，山东 济南 250014)

pH区带逆流色谱结合制备液相分离制备大黄根化学成分△

孙常磊1，2，王召平1，孙兆林1，耿岩玲2*，李佳1，杨鹏3

(1.山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355；2.山东省分析测试中心，山东 济南 250014；
3.济南三峰生物工程有限责任公司，山东 济南 250014)

目的：运用pH区带逆流色谱和制备液相分离制备大黄根的化学成分。方法：本研究以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶1∶1∶1)作为溶剂系统，上相加入10 mmol·L-1三氟乙酸(TFA)作为固定相，下相加入20 mmol·L-1NaOH作为流动相，转速为850 r·min-1，流速为2 mL·min-1，检测波长为254 nm，进行初步分离；尾吹液经制备液相进一步分离。结果：从750 mg大黄根粗提物中经一次pH区带逆流色谱分离得到反式桂皮酸(2) 85.8 mg和3个蒽醌类化合物：大黄酸(1)34.9 mg，芦荟大黄素(3)52.5 mg和大黄素(4)50.4 mg；经制备液相分离得到大黄酚(5)215.4 mg和大黄素甲醚(6)26.8 mg。经HPLC分析，其纯度分别为95.46%、97.28%、94.75%、95.02%、98.84%、98.12%。结论：大黄根中的化学成分具有有机酸的性质，可以运用pH区带逆流色谱进行分离，特别是与制备液相相结合，实现了不同酸性强度化合物的快速制备分离。

pH区带逆流色谱；制备液相；大黄；化学成分

大黄属于蓼科(Polygonaceae)大黄属(Rheum)多年生草本植物。《中华人民共和国药典》收载了掌叶大黄RheumpalmatumL.、唐古特大黄RheumtanguticumMaxim.ex Balf.和药用大黄RheumofficinaleBaill.。大黄味苦、性寒，归脾、胃、大肠、肝、心包经。具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄之功效[1]。其主要药效成分包括大黄素(emodin)、大黄素甲醚(physcion)、芦荟大黄素(aloe-emodin)、大黄酚(chrysophanol)、大黄酸(rhein)等1，8-二羟基蒽醌类衍生物[2]。现代药理学研究表明，大黄还具有保肝、利胆、强心、降压、抗肿瘤、抗高脂血症、免疫调节、清除自由基等功能[3-4]。鉴于大黄生物活性的多样性和药物来源复杂性，建立一种高效的分离大黄根中药效成分的方法，对于阐明其生物活性和作用机制，以及制订大黄质量控制标准都具有十分重要的意义。本研究建立了pH区带逆流色谱结合制备液相分离制备大黄根中化学成分的方法。经一次分离，得到6个高纯度化合物，即反式桂皮酸、大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚。

1 仪器与材料

1.1 仪器

TBE-300B高速逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司)，该分离系统包括多层聚四氟乙烯螺旋管(直径2.6 mm，分离体积300 mL)、TBP5002泵、8823B紫外检测器(北京宾达英创科技有限公司)和3057-11记录仪(重庆川仪总厂有限公司)；Waters 2695高效液相色谱系统(配有光电二极管阵列检测器(PDA)和自动进样装置，美国Waters公司)；普源高效液相色谱系统(配有紫外检测器，北京普源精电科技有限公司)。

1.2 材料

石油醚、乙酸乙酯、甲醇、三氟乙酸(TFA)和氢氧化钠等均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)，溶解和pH区带逆流色谱溶剂系统用水为去离子水；高效液相色谱和制备液相色谱用甲醇为色谱纯(山东禹王实业有限公司)，流动相的水为娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

大黄药材购于甘肃省，经山东中医药大学李佳教授鉴定为蓼科(Polygonaceae)大黄属(Rheum)植物掌叶大黄RheumpalmatumL.的干燥根。

2 方法

2.1 总蒽醌制备

1.0 kg大黄根粉末，用20% H2SO4和三氯甲烷按体积比1∶5混合，加热回流提取3次，每次提取2 h。过滤并合并提取液，减压回收溶剂得到粗提物。将三氯甲烷粗提物用等体积5% NaOH溶液萃取3次，合并萃取液用20% H2SO4调节pH为2左右，将酸化后的溶液用三氯甲烷萃取3次，减压回收三氯甲烷得大黄根的粗提物约30 g，用于pH区带逆流色谱分离[5]。

2.2 两相溶剂系统和样品溶液的制备

pH区带逆流色谱的溶剂系统为石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶1∶1∶1)，总体积为2 L，按比例将各种溶剂置于分液漏斗中混合，震荡后充分静置使其分层。使用之前分取上下相，其中上相中加入10 mmol·L-1TFA作为固定相，下相中加入20 mmol·L-1NaOH作为流动相，超声除去气泡，备用。

取750 mg大黄根的粗提物，用加入TFA的上相和不加NaOH的下相各10 mL超声溶解作为样品溶液。

2.3 分离和鉴定

2.3.1 pH区带逆流色谱分离过程 上相(固定相)以20 mL·min-1的流速高速注入高速逆流色谱仪的螺旋管中，待出口流出一定量的液体(约50 mL)，将上述溶解好的样品溶液从进样圈注入到高速逆流色谱仪中，启动仪器，将转速调节为850 r·min-1，待转速稳定后，以2 mL·min-1的流速泵入流动相，同时开启检测器和记录仪，检测器的检测波长设置为254 nm，待有组分从出口流出时开始手动收集馏分，平均每5 min收集1管，待分离结束，用压缩空气吹出螺旋管中的液体，计算固定相的保留率。

2.3.2 制备液相色谱分离过程 pH区带逆流色谱的尾吹液经减压浓缩后，用适量的甲醇溶解，样品浓度约为30 mg·mL-1，根据大黄根粗提物的HPLC分析条件确定尾吹液中混合组分的制备液相条件：色谱柱为YMC-Pack ODS-A(250 mm ×10 mm，5 μm)，甲醇-水(85∶15)为流动相，流速为3 mL·min-1，柱温为25 ℃，检测波长为254 nm，进样体积为250 μL，制备得到高纯度的大黄酚和大黄素甲醚。

2.3.3 HPLC分析和结构鉴定 大黄根粗提物以及经pH区带逆流色谱和制备液相分得的各组分分别用HPLC进行分析。色谱柱为YMC-Pack ODS-A(250 mm×4.6 mm，5 μm)；检测波长为254 nm；流动相为甲醇(A)-水(B)，梯度洗脱[0～20 min，60%～100%(A)，20～30 min，100%～100%(A)]；流速为1.0 mL·min-1；进样量为20 μL。pH区带逆流色谱和制备液相色谱所分得的各组分的化学结构根据ESI-MS和1H-NMR谱学数据进行鉴定。

3 结果与讨论

3.1 HPLC条件的优化

本研究考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液和乙腈-0.1%磷酸水溶液等作为流动相时，大黄根粗提物中各成分的分离效果。经测试发现，当采用甲醇-水进行梯度洗脱[0～20 min，60%～100%(A)；20～30 min，100%～100%(A)]；流速为1.0 mL·min-1时，各成分能够实现基线分离，如图1所示。

注：1.大黄酸；2.反式桂皮酸；3.芦荟大黄素；4.大黄素；5.大黄酚；大黄素甲醚。图1 大黄根粗提物的HPLC图

pH区带逆流色谱溶剂系统的选择不仅要求能够提供合适的KD值，而且要求对样品有较好的溶解性[6]。根据本实验室的分离经验[7]，结合大黄化学成分的极性和溶解性，本研究选择石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水作为溶剂系统。另外，考虑到蒽醌类化合物的弱酸性，需要用强碱作为洗脱碱，因此，选用TFA作为保留酸，NaOH作为洗脱碱进行分离。我们考察了如下几个溶剂系统：①石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶1∶1∶1)，上相加10 mmol·L-1TFA，下相加10 mmol·L-1NaOH；②石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶1∶1∶1)，上相加10 mmol·L-1TFA，下相加20 mmol·L-1NaOH；③石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶6∶5∶5)，上相加10 mmol·L-1TFA，下相加10 mmol·L-1NaOH；④石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶6∶5∶5)；上相加10 mmol·L-1TFA，下相加20 mmol·L-1NaOH。相比较而言，溶剂系统②和溶剂系统④能够提供较为合适的KD值。经实验测试发现，溶剂系统④并没有体现出较好的分离效果，反而增加了分离的时间，而溶剂系统②能够在较短的时间内完成分离，且分离效果没有太大差别，综合考虑选择溶剂系统②[石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶1∶1∶1)，上相加10 mmol·L-1TFA，下相加20 mmol·L-1NaOH]进行大黄根中化学成分的分离。经一次分离，从750 mg大黄根粗提物中分离得到反式桂皮酸(2)85.8 mg和3个蒽醌类化合物：大黄酸(1)34.9 mg，芦荟大黄素(3)52.5 mg和大黄素(4)50.4 mg，分离效果如图2所示。

图2 大黄根粗提物的pH区带逆流色谱图

3.2 制备HPLC条件的优化

根据3.1中选定的分析条件，分别考察了甲醇-水(80∶20)、甲醇-水(85∶15)和甲醇-水(90∶10)3个比例的流动相条件，经测试发现，当甲醇-水(85∶15)时，分离效果较好，能够实现基线分离且进样量可以扩大到250 μL，制备效果如图3所示。

图3 pH区带逆流色谱尾吹组分的制备液相分析图

3.3 化合物的纯度检测

利用优化好的液相色谱条件对分得的各组分(反式桂皮酸、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚)进行检测，纯度分别为95.46%、97.28%、94.75%、95.02%、98.84%、98.12%，分析结果及相应的结构式如图4所示。

3.4 化合物的结构鉴定

化合物1：ESI-MSm/z：283[M-H]-；1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：7.36(1H，d，J=8.0 Hz，H-7)，7.69(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，7.78(1H，dd，J=8.0 Hz，8.0 Hz，H-6)，7.68(1H，s，H-2)，8.05(1H，s，H-4)。以上数据和文献[5]报道的基本一致，确定化合物1为大黄酸。

图4 从大黄根中分离得到化合物的HPLC图

化合物2：ESI-MSm/z：147[M-H]-；1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：7.82(1H，d，J=16.0 Hz，H-7)，6.44(1H，d，J=16.0 Hz，H-8)，7.58(2H，m，H-2，H-6)，7.42(3H，m，H-3，H-4，H-5)。以上数据和文献[8]报道的基本一致，确定化合物2为反式桂皮酸。

化合物3：ESI-MSm/z：269[M-H]-；1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：4.71(2H，s，-CH2-OH)，7.32(1H，d，J=8.0 Hz，H-7)，7.78(1H，d，J=6.0 Hz，H-5)，7.73(1H，dd，J=8.0，6.0 Hz，H-6)，7.82(1H，s，H-4)，7.37(1H，s，H-2)。以上数据和文献[5]报道的基本一致，确定化合物3为芦荟大黄素。

化合物4：ESI-MSm/z：269[M-H]-；1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：2.42(3H，s，-CH3)，6.59(1H，d，J=2.0 Hz，H-2)，7.26(1H，d，J=2.0 Hz，H-4)，7.07(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，7.52(1H，d，J=2.0 Hz，H-5)。以上数据和文献[5]报道的基本一致，确定化合物4为大黄素。

化合物5：ESI-MSm/z：253[M-H]-；1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：2.45(3H，s，-CH3)，7.12(1H，s，H-2)，7.63(1H，s，H-4)，7.31(1H，d，J=8.0 Hz，H-7)，7.64(1H，dd，J=8.0，8.0 Hz，H-6)，7.80(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)。以上数据和文献[5]报道的基本一致，确定化合物5为大黄酚。

化合物6：ESI-MSm/z：283[M-H]-；1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：2.45(3H，s，-CH3)，3.92(3H，s，-OCH3)，6.71(1H，d，J=2.4 Hz，H-7)，7.12(1H，s，H-2)，7.31(1H，d，J=2.4 Hz，H-5)，7.64(1H，s，H-4)，7.80(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)。以上数据和文献[9]报道的基本一致，确定化合物6为大黄素甲醚。

4 小结

本研究应用pH区带逆流色谱技术分离出大黄根中酸性较强的化合物(反式桂皮酸、大黄酸、芦荟大黄素和大黄素)；对于酸性较弱的化合物(大黄酚和大黄素甲醚)，通过制备HPLC进行了分离。从而实现了pH区带逆流色谱与制备HPLC的结合，建立了一种快速、高效制备分离大黄根中化学成分的方法。这种结合技术同样适合其他类化合物的分离与制备。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：23-24.

[2] 高亮亮.唐古特大黄、药用大黄和掌叶大黄的化学成分和生物活性研究[D].北京：北京协和医学院，2012.

[3] 罗培，徐象珍，谭正怀.大黄游离蒽醌致泻作用机制研究[J].中药药理与临床，2013，29(3)：88-90.

[4] 范妙璇，赵海誉，王一涛.中药大黄现代药理学研究与中西医结合的应用[J].中国医药指南，2009，7(8)：41-43.

[5] Tong S Q，Yan J H.Large-scale separation of hydroxyanthraquinones fromRheumpalmatumL.by pH-zone-refining counter-current chromatography[J].J Chromatogr A，2007，1176(1)：163-168.

[6] Ito Y.Golden rules and pitfalls in selecting optimum conditions for high-speed counter-current chromatography[J].J Chromatogr A，2005，1065(2)：145-168.

[7] 吴秋霞，孙常磊，王晓，等.高速逆流色谱分离制备大黄化学成分[J].山东科学，2015，28(1)：1-6.

[8] 张修朋，秦辉，杨芳，等.黄素馨化学成分及其抗氧化活性[J].中国中药杂志，2014，39(11)：2029-2033.

[9] Guo S Y，Feng B，Zhu R N，et al.Preparative isolation of three anthraquinones fromRumexjaponicusby high-speed counter-current chromatography[J].Molecules，2011，16(2)：1201-1210.

SeparationandPurificationofAnthraquinonesfromRootofRheumpalmatumL.bypH-Zone-refiningCounter-currentChromatographyandPreparativeHPLC

SUN Changlei1，2，WANGZhaoping1，SUNZhaolin1，GENGYanling2*，LIJia1，YANGPeng3

(1.CollegeofPharmacy，ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250355，China；2.ShandongAnalysisandTestCenter，Jinan250014，China；3.SanfengBiologicalEngineeringTechnologyCo.Ltd.，Jinan250014，China)

Objective：To separate and purify the compounds from the root ofRheumpalmatumL. by pH-zone-refining counter-current chromatography and preparative HPLC.Methods：The solvent system used in this separation was petroleum-ether-ethyl acetate-methanol-water (1∶1∶1∶1). 10 mmol·L-1TFA was added to the upper phase as stationary phase and 20 mmol·L-1NaOH was added to the lower phase as mobile phase. The revolution speed is 850 r·min-1and the flow rate is 2 mL·min-1. The effluent was continuously monitored by a UV monitor at 254 nm. The make-up fluid was further separated by preparative HPLC.Results： From 750 mg extract ofRh.palmatumL. root, 85.8 mg cinnamic acid (2) and three anthraquinones 34.9 mg rhein (1), 52.5 mg aloe-emodin (3) and 50.4 mg emodin (4) were obtained in a single run. And 215.4 mg of chrysophanol and 26.8 mg of physcion were obtained by the preparative HPLC. The purities of these compounds are 95.46%, 97.28%, 94.75%, 95.02%, 98.84% and 98.12% analyzed by HPLC.Conclusion：The compounds ofRh.palmatumL. root as weakly acidic compounds could be separated by pH-zone-refining counter-current chromatography. When combined with the preparative HPLC, an efficient method has been established for the separation of these compounds.

pH-Zone-refining counter-current chromatography; preparative HPLC;RheumpalmatumL.; compounds

2015-07-07)

山东省科技发展计划项目(2014GZX219003)

*

耿岩玲，副研究员，硕士，研究方向：天然产物研究与开发；Tel：(0531)82605319，E-mail：gengyanling@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.5.003