湖北省英山县汉族女性MTHFR和MTRR的遗传多态性分析

徐小惠，鲁衍强，李　瑛，贾文静，杨　琦



湖北省英山县汉族女性MTHFR和MTRR的遗传多态性分析

徐小惠1，鲁衍强2，李瑛2，贾文静2，杨琦3

(1.湖北省黄冈市英山县妇幼保健院，湖北 黄冈438700；2.上海靶向分子医学研究所，上海200433；3.中国疾病预防控制中心妇幼保健中心，北京100101)

目的分析湖北省黄冈市英山县汉族育龄女性叶酸代谢相关酶5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)的基因多态性分布特征，以指导育龄女性增补叶酸和出生缺陷的一级预防。方法以英山县319例汉族女性为研究对象，提取口腔黏膜上皮细胞基因组DNA，通过荧光定量PCR法对MTHFR和MTRR的多态性位点进行分析，获得英山县妇女该基因的分布特征，并与已报道的其他地区的数据进行比较。结果英山县汉族女性MTHFR C677T基因型构成与淄博、济源、张家口、延边、乌鲁木齐、银川、眉山、南宁、琼海数据相比差异有统计学意义(χ2值为181.41～13.46，均P<0.05)，与松滋、湘潭、惠州相比无统计学意义(χ2值为0.12～5.87，均P>0.05)。英山县汉族女性MTHFR A1298C基因型构成与淄博、济源、张家口、延边、银川、眉山、松滋、湘潭数据的差异均有统计学意义(χ2值为76.94～7.31，均P<0.05)，与乌鲁木齐、惠州、南宁、琼海相比无统计学意义(χ2值为5.19～0.97，均P>0.05)。英山县汉族女性MTRR A66G的基因型构成与延边和琼海的差异有统计学意义(χ2值分别为6.10、17.10，均P<0.05)，与淄博、济源、张家口、乌鲁木齐、银川、眉山、松滋、湘潭、惠州、南宁的差异均没有统计学意义(χ2值为0.95～5.48，均P>0.05)。结论英山县汉族女性MTHFR和MTRR基因多态性频率分布具有地域特异性。

亚甲基四氢叶酸还原酶；甲硫氨酸合成酶还原酶；基因多态性

[Abstrac]Objective To explore the genotype distribution of 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) and methyltransferase reductase (MTRR) involved in folic acid biosynthetic pathway among Chinese Han gestational age women in Yingshan City in Hubei Province, so as to guide folic acid supplement and primary prevention of birth defects. Methods Genomic DNA was obtained from the oral mucosa cells of 319 females in Han nationality in Yingshan City, and PCR method was used to analyze MTHFR and MTRR gene polymorphisms and obtain distribution of gene polymorphisms. They were compared with the reported data of other regions in China. Results The genotype distribution of MTHFR C677T among Yingshan women was significantly different to that among women in Zibo, Jiyuan, Zhangjiakou, Yanbian, Urumchi, Yinchuan, Meishan, Nanning and Qionghai (χ2value ranged 181.41-13.46, respectively, allP<0.05), but it was not significantly different to that in Songzi, Xiangtan and Huizhou (χ2value ranged 0.12-5.87, respectively, allP>0.05). The genotype distribution of MTHFR A1298C among Yingshan women was significantly different to that in Zibo, Jiyuan, Zhangjiakou, Yanbian, Yinchuan, Meishan, Songzi and Xiangtan (χ2value ranged 76.94-7.31, respectively, allP<0.05), but it was not significantly different to Urumchi, Huizhou, Nanning and Qionghai (χ2value ranged 5.19-0.97, respectively, allP>0.05). The genotype distribution of MTRR A66G among Yingshan women was significantly different to Yanbian and Qionghai (χ2value was 6.10 and 17.10, respectively, bothP<0.05), while there was no significant difference to Zibo, Jiyuan, Zhangjiakou, Urumchi, Yinchuan, Meishan, Songzi, Xiangtan, Huizhou and Nanning (χ2value ranged 0.95-5.48, respectively, allP>0.05). Conclusion The polymorphism frequency distribution of MTHFR and MTRR in Han women in Yingshan City is region specific.

[Key words]methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR); methyltransferase reductase (MTRR); polymorphism

近年来研究表明，叶酸代谢障碍及高同型半胱氨酸血症不仅与胎儿出生缺陷密切相关，也可影响到心血管等方面的疾病，而5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(methylene￣tetrahydrofolate reductase，MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(methyltransferase reductase，MTRR)是参与体内叶酸代谢的关键酶，Nishio等于2008年研究发现，MTHFR基因多态性会影响体内叶酸及同型半胱氨酸水平，并且其分布有民族以及地域间的差异。本研究针对英山县汉族育龄女性开展大样本的分子流行病学调查，对该人群的基因多态性分布进行统计分析，旨在阐明本地区人群的遗传特征，为个体化的孕期保健提供依据。

1材料与方法

1.1研究对象

选择2014年7月至2015年4月在英山县妇幼保健院就诊的汉族女性为研究对象，经患者知情同意，采集口腔黏膜细胞进行遗传检测。排除非英山县人群以及标本不合要求者。共获取有效样本319例，患者平均年龄26.53±5.43岁。

1.2研究方法

用棉拭子采集患者的口腔黏膜细胞，采用柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取样本DNA。Taqman-MGB探针荧光定量PCR检测MTHFR C677TA1298C和MTRR A66G的基因多态性。相关仪器、试剂均购于美国ABI公司。每个反应体系总体积10μL，包含浓度为20ng/μL的DNA模板1μL,2 x Taqman Universal MasterMix 5μL,20 x Taqman-MGB探针0.5μL，去离子水3.5μL。反应条件为95℃10min，随后进行20个循环的扩增(92℃15s，60℃1min)，再进行30个循环的扩增(89℃15s，60℃90s)。反应结束后在ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品孔中的终点荧光，利用分析软件确定各个样本的基因分型结果。

1.3统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，应用Haplo View4.2软件进行SNPs的Hardy-Weinberg平衡、连锁不平衡(linkage disequilibrium，LD)水平和单倍型结构分析。计数资料采用率表示，对基因型及等位基因频率进行χ2检验，检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1英山县汉族育龄女性MTHFR、MTRR基因多态性的分析

对检测到的MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位点分别进行遗传平衡检验，均符合H-W遗传平衡检验，证明样本具有本区域的代表性。

2.2 MTHFR、MTRR基因型和等位基因频率在不同地区汉族女性中的比较

2.2.1英山县汉族女性 MTHFR、MTRR基因型分布

英山县汉族女性MTHFR C677T基因型构成与淄博、济源、张家口、延边、乌鲁木齐、银川、眉山、南宁、琼海数据相比差异有统计学意义(均P<0.05)，与松滋、湘潭、惠州相比无统计学意义(均P>0.05)。 英山县汉族女性MTHFR A1298C基因型构成与淄博、济源、张家口、延边、银川、眉山、松滋、湘潭数据的差异均有统计学意义(均P<0.05)，与乌鲁木齐、惠州、南宁、琼海相比无统计学意义(均P>0.05)。英山县汉族女性MTRR A66G的基因型构成与延边和琼海的差异有统计学意义(均P<0.05)，与淄博、济源、张家口、乌鲁木齐、银川、眉山、松滋、湘潭、惠州、南宁的差异均没有统计学意义(均P>0.05)，见表1。

2.2.2英山县汉族女性MTHFR、MTRR等位基因频率分布

英山县汉族女性的MTHFR 677T等位基因频率显著低于淄博、济源、张家口、延边、银川、乌鲁木齐、眉山、惠州、南宁、琼海(均P<0.05)，与松滋、湘潭无显著性差异(均P>0.05)。MTHFR 1298C等位基因频率显著高于淄博、济源、张家口、延边、银川、乌鲁木齐、松滋、眉山、湘潭(均P<0.05)，与惠州、南宁和琼海无显著性差异(均P>0.05)。MTRR 66G等位基因频率显著低于琼海(P<0.05)，但与张家口、湘潭、松滋、乌鲁木齐、惠州、眉山、延边、银川、南宁、济源、淄博的差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表2。

表1　不同地区汉族女性MTHFR、MTRR基因型频数和频率分布比较[n(%)]

注：＊P<0.05，＊＊P<0.01。

表2　不同地区汉族女性MTHFR、MTRR等位基因频数和频率分布比较[n(%)]

注：＊P<0.05，＊＊P<0.01。

2.3 MTHFR基因677、1298位点连锁情况及单倍型分析

MTHFR C677T和A1298C两位点组合情况见表3。用现有数据对英山县汉族女性MTHFR基因677C/T与1298A/C两位点构建单倍型，发现在这一群体中主要以677C-1298A(40.10%)和677T-1298A(34.40%)两种组合形式存在，还有部分677C-1298C(25.30%)以及少量677T-1298C(0.30%)类型。经连锁不平衡分析，本县汉族女性人群677与1298两位点间存在强连锁不平衡现象(D'=0.97)。

表3MTHFR C677T和A1298C连锁型分布[n (%)]

Table 3　Linkage distribution of MTHFR C677T and A1298C[n (%)]

3讨论

3.1 5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶与出生缺陷的关系

叶酸是一种水溶性维生素，广泛存在于绿色蔬菜与水果中，是四氢叶酸的主要成分，四氢叶酸作为细胞生化反应中甲基的主要供应者，参与嘌呤与嘧啶的合成及HCY向蛋氨酸转化中的甲基反应。而MTHFR、MTRR则为叶酸-甲硫氨酸代谢途径中的关键酶，其基因位点突变可引起相应的酶活性降低，从而引起叶酸和甲硫氨酸代谢障碍，最终造成叶酸吸收的下降以及HCY在人体内蓄积。

MTHFR上的C677T、A1298C位点的基因型发生突变，会导致MTHFR的酶活性及热稳定性下降，TT基因型对应的酶活性下降到正常的22%。MTHFR 677CT和1298AC存在协同作用，会导致对应的酶活性下降到正常的36%。MTRR 66AA基因型与66GG基因型相比，个体发生神经管畸形风险增加2.6倍 (OR=2.6，95%CI= 1.3～5.3) 。这3个基因位点的突变均为错义突变。

随着产前诊断技术的进步和孕期叶酸补充等措施的实施，近年新生儿出生缺陷发病率虽然有所降低，但每年新发生出生缺陷仍高达90万例，因此，通过对育龄女性进行遗传筛查，即MTHFR和MTRR多态性检测，针对存在叶酸代谢障碍的遗传风险人群，采取相应干预措施，已成为有效达到出生缺陷及孕期疾病一级预防目的的重要方法。

3.2 英山及全国叶酸代谢基因位点多态性

英山县女性易感基因MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位点多态性与其他地区汉族女性的频率存在差异。MTHFR 677T等位基因频率呈现北方高南方低的趋势，与我国出生缺陷发病率北方高南方低的趋势一致。研究表明，T基因型孕龄女性在低叶酸饮食及未服用叶酸增补剂的情况下，其胎儿唇腭裂的发生风险均会增加，若以上两种情况同时存在，则风险进一步增高。反之，如果能够补服叶酸增补剂、提高饮食中叶酸的含量则可以降低胎儿唇腭裂的发生风险[13]。

3.3多态性研究的重要性

MTHFR C677T基因多态性与神经管畸形的关系已有大量证据证明，叶酸增补预防神经管畸形是20世纪公共卫生领域取得的最重要成果之一。但是，由于受教育程度、医疗资源、饮食环境等地域性差异的限制，我国贫困地区叶酸增补依从性依然较低，因此以神经管畸形为主的出生缺陷仍呈高发态势[14]，进一步的健康教育和预防措施(叶酸增补)仍然十分重要。通过对育龄女性进行遗传筛查，针对存在叶酸代谢障碍的遗传风险人群，采取增加营养素补充、加强红细胞叶酸水平监测、提高产前筛查和孕期管理依从性等干预措施，是有效达到出生缺陷及孕期疾病一级预防目的的重要方法，也是提高人口素质的必要手段。

[1]从玉英,鲁衍强,芮欣忆,等.淄博市汉族女性亚甲基四氢叶酸还原酶和甲硫氨酸合成酶还原酶基因多态性分布研究[J].现代妇产科进展,2012,21(10):779-781.

[2]陈小利,鲁衍强,马少杰,等.济源市汉族女性MTHFR与MTRR基因多态性分布研究[J].中国妇幼卫生杂志,2014,5(4): 17-20.

[3]高峡,鲁衍强,马少杰,等.张家口地区汉族女性MTHFR和MTRR基因多态性分布[J].中国优生与遗传杂志,2014,22(11):35-37.

[4]于延辉,鲁衍强,李瑛,等.延边州汉族女性MTHFR和MTRR基因遗传多态性调查[J].中国计划生育学杂志,2015,23(9):591-594.

[5]刘晓玲,鲁衍强,李瑛,等.银川市汉族女性MTHFR与MTRR基因多态性研究[J].宁夏医科大学学报,2014,36(11):1216-1219.

[6]郝友英,赵红,鲁衍强,等.新疆维吾尔族和汉族女性MTHFR和MTRR基因单核苷酸多态性比较[J].中国妇幼保健, 2014,29(21):3495-3497.

[7]向长港,鲁衍强,马少杰,等.眉山市656例汉族女性MTHFR与MTRR基因多态性分析[J].山东医药,2015,53(14): 22-25.

[8]罗秀莉,鲁衍强,郭文竹,等.湖北松滋市汉族女性MTHFR与MTRR基因多态性分布[J].公共卫生与预防医学,2014,25(2):29-32.

[9]王淑媛,鲁衍强,马少杰,等.湘潭市汉族女性MTHFR和MTRR基因多态性分布及其与血浆Hcy水平的关系[J].天津医药.2014,42(12):1205-1209.

[10]高利洁,鲁衍强,芮欣忆,等.惠州市汉族女性亚甲基四氢叶酸还原酶和甲硫氨酸合成还原酶基因多态性分布研究[J].中山大学学报(医学科学版),2013,34(1): 140-143.

[11]蒋武,鲁衍强,李瑛,等.南宁市壮族和汉族女性MTHFR和MTRR基因单核苷酸多态性比较[J].广西医学,2014,36(11):1517-1519.

[12]颜珠苗,鲁衍强,李瑛,等.琼海市汉族女性MTHFR和MTRR基因多态性分布研究[J].海南医学院学报,2013,19(1):18-20,24.

[13]Ali A,Singh S K,Raman R.MTHFR 677TT alone and IRF6 820GG together with MTHFR 677CT,but not MTHFR A1298C,are risks for nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate in an Indian population[J].Genet Test Mol Bioma,2009,13(3): 355-360.

[14]Li X H,Zhu J,Wang Y P,etal.Geographic and urban-rural disparities in the total prevalence of neural tube defects and their subtypes during 2006-2008 in China: a study using the hospital-based birth defects surveillance system[J].BMC Public Health,2013,13:161.

[专业责任编辑：游川]

Gene polymorphism of methylenetetrahydrofolate reductase and methionine synthase among Han gestational age women in Yingshan City in Hubei Province

XU Xiao-hui1, LU Yan-qiang2, LI Ying2, JIA Wen-jing2, YANG Qi3

(1.Maternal and Child Health-care Hospital of Yingshan City, Hubei Huanggang 438700, China;2. Institute of Targeted Therapy and Molecular Medicine of Shanghai, Shanghai 200433, China;3.National Center for Women and Children’s Health, China CDC, Beijing 100101, China )

2015-06-15

徐小惠(1974-)，女，副主任医师，主要从事妇女保健工作。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.02.036

R715.5

A

1673-5293(2016)02-0252-04