气相色谱-质谱联用仪测定生物检材中钩吻生物碱

蔡玉刚，张　帆（.四川省泸州市公安局刑事科学研究所，四川泸州646000；.西南医科大学司法鉴定中心，四川泸州646000）

气相色谱-质谱联用仪测定生物检材中钩吻生物碱

蔡玉刚1，张帆2
（1.四川省泸州市公安局刑事科学研究所，四川泸州646000；2.西南医科大学司法鉴定中心，四川泸州646000）

目的：利用气相色谱-质谱联用仪建立一种方法，可以有效检验中毒案件生物检材中钩吻生物碱主要成分钩吻碱子和钩吻碱甲。方法：利用相似相容原理对生物检材中的钩吻生物碱进行液液提取；固相萃取对有效成分的滞留性对钩吻碱进行提取，两种提取方法的优越性进行评价；探索一种对钩吻生物碱检验相适应的气相-质谱条件。结果评价：以1μg/mL钩吻碱甲对仪器进行质量控制检测，方法可以满足检测需要。通过空白添加提取，液液提取和固相萃取的回收率均大于80%，方法均满足检验要求。液液提取与固相萃取的平行比较，液液提取的回收率比固相萃取较小，故固相萃取优于液液提取。

钩吻；气质联用；固相萃取；液液提取

钩吻（Gelsemium elegans Benth.），为马钱科、钩吻属常绿木质藤本，别名野葛、胡蔓藤、断肠草、朝阳草等，小枝圆柱形，幼时具纵棱；除苞片边缘和花梗幼时被毛外，全株均无毛。叶片膜质，卵形、卵状长圆形或卵状披针形，种子扁压状椭圆形或肾形，边缘具有不规则齿裂状膜质翅。花期5～11月，果期7月至翌年3月。主要功效：破积拔毒，祛瘀止痛，杀虫止痒。镇痛；镇静；抗炎；散瞳；抗肿瘤；毒性。主治疥癞，湿疹，瘰疬，痈肿，疔疮，跌打损伤，风湿痹痛，神经痛。全草有毒，有毒成分是钩吻生物碱，主要有钩吻碱子（Koumine）、钩吻碱甲（Gelsemine）、钩吻碱寅（Kouminicine）、钩吻碱卯（Kouminidine）、钩吻碱辰（Kounidine）、钩吻碱丙（Sempervine）、钩吻碱丁（Koumicine）、钩吻碱戊（Koumikine）等，其中含量最高的为钩吻碱子，其次为钩吻碱甲。因此，对生物检材中钩吻碱子和钩吻碱甲成分的检验是判断钩吻中毒的重要途径。钩吻碱子和钩吻碱甲易溶于乙醚、氯仿、乙醇，难溶于水（见图1～2）。

钩吻中毒的临床表现：视中毒药量大小及种类而不同。药量小者先出现消化系统症状，继而出现神经系统症状，药量大者可迅速出现昏迷、严重呼吸困难、呼吸肌麻痹室息死亡。多在进食即刻及30min发病。消化系统表现口腔及咽喉灼痛、恶心、呕吐、腹胀痛、出现腹水。神经系统表现眩晕、眼睑下垂、吞咽困难、四肢麻木、无力、肌震颤、言语不清、烦躁不安、昏迷、抽搐、角弓反张、死亡。呼吸、循环系统表现呼吸先快后慢，不整，呼吸衰竭；心慌，心率先快后慢，心音低，血压下降。其它表现皮肤变黑、发热、瞳孔散大、复视、视物不清。在现实钩吻中毒案件中以错误使用（内服）较多。中毒案件社会影响比较大，检验前对中毒症状或者尸体解剖的了解，针对性检验可以有效节约时间。

图1　钩吻碱子

图2　钩吻碱甲

1　实验材料

1.1试剂及标准品

（1）标准对照品：钩吻碱子、钩吻碱甲；

（2）所用乙醇、乙醚、氯仿等试剂均为分析纯。

1.2仪器和设备

（1）安捷伦7890-5975气相色谱质谱联用仪（GC/MS）；

（2）ThermoTDZ5高速离心机；

（3）振荡器；

（4）安捷伦简易型固相萃取仪。

1.3操作步骤

1.3.1溶液配制

（1）配制浓度均为1mg/mL的钩吻碱子和钩吻碱甲的单一标准对照品甲醇或乙醇储备液，低温保存，有效期12个月。

（2）配制10μg/mL钩吻碱子和钩吻碱甲的单一标准对照品甲醇或乙醇工作液，低温保存，有效期6个月。

1.3.2液液萃取法

取检材2.0～5.0mL（g），加氢氧化钠溶液调pH＞9，2～3倍于检材的乙醚或氯仿提取2次，合并有机提取液氮气吹干，加50～200μL甲醇或乙醇溶解供检。

同时取等量类似空白检材2份，1份作空白对照检材，另1份添加1μg钩吻碱子作质量控制检材，与检材平行操作。

1.3.3固相萃取法

（1）固相萃取：

取检材1.0mL（g）～3.0mL（g），加入2%（v/v）甲醇水溶液3～6mL混匀，超声或涡旋振荡5～10min，8000r/min以上离心5～10min，取上清液进行固相萃取。洗脱液氮气吹干，50～200μL甲醇或乙醇溶解供检验。

同时取等量类似空白检材2份，1份作空白对照检材，另1份添加1μg钩吻碱子作质量控制检材，与检材平行操作。

（2）固相萃取条件：

固相柱：以聚苯乙烯-二乙烯基苯-吡咯烷酮或其它类似物质为固相主要成分。

活化：先后用2～4mL甲醇、2～4mL蒸馏水分别以1～2mL/ min的流速活化柱子；

上样：以0.5～1mL/min的流速上样；

洗涤：2～4mL水以1～2mL/min过柱洗涤杂质；

吹干：氮吹10min以上或离心干燥固相柱；

洗脱：1～3mL乙醚以0.5mL/min的流速洗脱。

1.4检验

GC/MS检验条件：

色谱柱：非极性或弱极性弹性石英毛细管柱；

柱温程序：120℃（2min）10℃/min280℃（12min）；

进样口温度280℃，传输线温度280℃；

柱流量：恒流1mL/min；

进样模式：分流进样，分流比10～30：1；

离子源：EI；

溶剂延迟3min；

扫描方式：scan模式，质量范围40～550amu。

2　结果分析

将钩吻碱子、钩吻碱甲、1.3.1和1.3.2提取所得的样品供按1.4的GC/MS条件进行分析，钩吻碱子和钩吻碱甲标准液的总离子流图和质谱图（图3）。所设检测条件下待测样品中钩吻碱子的保留时间为15.493min，钩吻碱甲的保留时间为15.787min，GC/MS质谱碎片主要的特征离子峰为：m/z 108（基峰）、m/z 251、m/z 279、m/z 322。其质谱图与标准品库中钩吻碱子和钩吻碱甲的标准质谱图特征一致（见图4）。

3　案例应用

钩吻具有药用价值但毒性较大，一般仅作外用药使用，在山区，每一年都会有多起由于误食钩吻所泡的酒而引起中毒。2013年2月，××省××市110接报案称：×县×村有17人因为喝了药酒出现中毒症状，已有一人死亡，其他人正在抢救。笔者亲自勘查了该现场，现场提取了喝剩的酒以及17人吃剩的饭菜，及法医解剖死者所得的胃内容、心血及肝组织。其中喝剩的酒、胃内容、心血及肝组织按本文建立的实验条件通过GC/ MS分析均检出了钩吻碱子和钩吻碱甲成分。从而认定该事件为误食钩吻药酒造成的钩吻碱中毒的意外事故。

图3　总离子流图

图4　钩吻碱甲质谱图

4　结论

本文建立了钩吻碱中主要成分钩吻碱子和钩吻碱甲的GC/MS定性检验方法，有助于钩吻碱的日常检验鉴定，从而为案件的性质及侦破提供有力支撑。

TQ450.26

A

2095-2066（2016）25-0267-02

2016-8-20

蔡玉刚（1980-），男，汉族，理化检验工程师，大学本科，主要从事理化检验工作。

张 帆（1983-），男，汉族，法医师，大学本科。

［1］中国刑事科学技术大全·毒品和毒物检验.2003，1（第1版）：353～357.