液氮蒸汽熏蒸时间对犬精子冷冻效果的影响

滑志民，张似青，赵熠群，张陈华，曾　晖，杜　波

(上海农林职业技术学院 动物科学技术系，上海 201699)



液氮蒸汽熏蒸时间对犬精子冷冻效果的影响

滑志民，张似青，赵熠群，张陈华，曾晖，杜波

(上海农林职业技术学院 动物科学技术系，上海 201699)

本试验研究了0.5 mL细管冷冻保存犬精液过程中液氮熏蒸时间对精子冷冻效果的影响。试验分为5组，将精液细管置于液氮液面上方2 cm处，分别熏蒸0 min(直接投入液氮)、1 min、2 min、4 min、8 min。解冻后通过活率、活力、畸形率及顶体完整率对精子进行评估。结果：液氮蒸汽熏蒸0 min和1 min组精子活率和活力显著低于其它各组(P<0.05)。与直接投入液氮相比，在液氮蒸汽中预冷冻超过2 min能够提高精子顶体完整率(P<0.05)。本试验表明在使用0.5 mL细管冷冻犬精子时，液氮熏蒸时间在4～8 min较为适宜。

犬；精子冷冻；液氮熏蒸

犬精子冷冻技术可有效解决名贵种公犬稀少，跨地域配种，种公犬因腿伤不能配种等问题，还可充分发挥种公犬的繁殖潜能，加快优良基因的扩散及种质资源保存等。在我国，犬采用冷冻精液人工授精还没有广泛开展，但也有一些研究和尝试。在精液冷冻过程中降温速度是影响冷冻效果的重要因素之一，有些研究已经开始用程序降温冷冻仪来精确控制冷冻降温速度和过程，但多数还是用液氮熏蒸法冷冻犬的精液，该法操作简单，无需特殊冷冻设备。本试验就液氮熏蒸时间对犬精子冷冻效果进行了研究。

1　材料与方法

1.1试验动物

试验犬为中型毕格公犬5只，2～6岁，健康，繁殖性能良好，均能正常采精。饲养于上海农林职业技术学院实验动物场，犬舍带有运动场，每日饲喂两次商品犬粮，自由饮水。

1.2主要器材和试剂

0.5 mL细管(富士平)、显微镜(SMZ745，尼康公司)、显微镜用恒温板(HW-1，金坛市宏华仪器厂)，自动精液分析仪(北京伟力新世纪科技发展有限公司)、恒温台(QB2000，海南其林贝尔仪器制造有限公司)、电热恒温水浴箱(HH-W420金坛市医疗仪器厂)、电子天平(AL204，梅特勒-托利多公司)。冷冻液配制所需药品及试剂均购自Sigma公司。

1.3精液采集

采用按摩法采精，每3 d采精1次。采精前用37°C无菌生理盐水清洗包皮内外，然后用一只手握住阴茎龟头球部位进行反复按摩，待其阴茎充分勃起射精后，另一手持无菌烧杯收集乳白色富含精子的部分。将烧杯中的精液转移入无菌离心管，置于37°C水浴中保温。经镜检，活力达到0.7以上为合格精液，用于试验研究[1]。

1.4精液冷冻保护液的配制

将2.4 g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，1.4 mg/mL柠檬酸，0.8 g葡萄糖，5万IU青霉素，5万IU链霉素溶于100 mL纯水中，用磁力搅拌器搅拌30 min混合均匀，过滤除菌备用。上述溶液配好后加入20%的卵黄和5%的甘油配成精液稀释液。

1.5精液稀释与冷冻

将采集的所有精液混合，精液密度仪测定密度，按照稀释后密度为8×107个/mL来计算稀释倍数，采用二次稀释法立即稀释。首先将已预热到37°C的稀释液缓慢地注入到含有鲜精的试管中，精液与稀释液比例为1∶1，缓慢摇匀后放入4 ℃冰箱平衡1.5 h，从冰箱中取出，加入4°C稀释液，最终精子的密度调整为8×107个/mL，再次放入4 ℃冰箱平衡30 min，精液分装于0.5 mL的细管中，封口，做好标记，准备冷冻。

精液冷冻采用液氮熏蒸法预冷，将装入精液的细管置于冷冻架上，细管与液氮面保持2 cm。根据试验设计设置不同的熏蒸时间，熏蒸后投入液氮中保存1周以上。

1.6精液的解冻与质量评定

将细管从液氮中取出，迅速投入37 ℃的水浴中，保持20 s解冻，显微镜下检测精子活率和活力，通过Giemsa染色检查精子畸形率和顶体完整率[1]。

1.7试验设计

试验分为5组，根据细管在液氮蒸汽中熏蒸时间的不同分为：0 min(直接投入液氮)、1 min、2 min、4 min、6 min和8 min组。冷冻好的精子解冻后，检查其活率、活力、畸形率和顶体完整率，来确定较适当的熏蒸时间。每组取3只细管解冻检查，数据以3次平均值来表示。

1.8数据分析

数据分析应用Excel软件中的方差分析。

2　结果

通过表1可看出，液氮蒸汽预冷冻2 min、4 min、8 min三组间精子活率和精子活力没有显著差异(P>0.05)，而三组均极显著高于液氮蒸汽熏蒸0 min组(P<0.01)，显著高于液氮蒸汽熏蒸1 min组。同时液氮蒸汽熏蒸1 min组的精子活率和精子活力均显著高于液氮蒸汽熏蒸0 min组(P<0.05)。

表1液氮蒸汽熏蒸时间对精子活动力的影响

液氮蒸汽熏蒸时间/min01248精子活率/%3.26±0.58aA23.09±2.21bAB41.95±5.84cB49.20±3.96cB48.73±4.57cB精子活力/%2.48±0.39aA18.73±1.88bAB33.52±3.28cB42.83±4.02cB42.49±4.13cB

注：同一行内不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，同一行内不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

表2液氮蒸汽熏蒸时间对精子顶体和形态的影响

形态检查液氮蒸汽熏蒸时间/min01248顶体完整率/%26.59±3.56a37.93±5.79a58.46±5.73b61.18±5.04b60.62±3.68b畸形率/%29.39±2.87a31.76±2.02a33.58±3.37a35.37±3.52a36.21±3.98a

注：同一行内不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

由表2可知，在顶体完整率方面，液氮蒸汽熏蒸2 min、4 min、8 min三组无显著差异(P>0.05)，但三组均比液氮蒸汽熏蒸1 min和0 min组有显著升高(P<0.05)。畸形率方面，各组之间没有显著差异(P>0.05)。

3　讨论

本试验表明，在使用0.5 mL细管冷冻保存犬精液时，熏蒸0 min，即直接投入液氮，解冻后精子存活率和精子活力极低，分别只有3.26%和2.48%。而样品即使在液氮蒸汽中熏蒸1 min，精子运动能力也显著提高，精子存活率和精子活力达到了23.09%和18.73%，在液氮蒸汽预冷冻大于2 min，效果更显著，精子活率达40%以上。这表明过于快速的降温对精子会造成致死性的损伤。在熏蒸2 min以上各组精子顶体完整率较直接投入液氮也有显著提高。精子的顶体是覆盖于精子核前2/3以上区域的囊性结构，冷冻过程会导致精子质膜和顶体受到不同程度的损伤。有研究认为冷冻对犬精子顶体结构破坏较牛精子更为严重，主要表现为顶体的空泡化和膨胀[3]。本试验表明，将犬精液细管不经液氮蒸汽预冷冻，直接投入液氮，对精子顶体会造成较严重的损伤。在精液冷冻过程中，如果降温速度太快，大量的水分会滞留在细胞中，导致细胞内冰晶的形成，细胞膜受损，进而死亡。另外一方面，如果降温速度太慢，细胞外液先形成冰晶，细胞内水分子会向细胞外流动，细胞可能皱缩，胞内溶质浓度过高，也会对精子造成损害。总之，合适的降温速度是精液冷冻成功的关键因素之一。当然，降温速度通常还与细管的容量、冷冻保护液的成分、熏蒸时细管距液氮面的高度等因素有关。

本试验表明，在使用0.5 mL细管冷冻犬精子时，细管在距液氮面2 cm的情况下，液氮熏蒸时间不应低于2 min，推荐熏蒸时间在4～8 min较为适宜。

[1]高雅，罗桂河，李卫东，等.不同浓度乙二醇和甘油对犬精液冷冻效果的影响[J].中国农学通报，2010，26(8)：25-28.

[2]刘璐，张劭俣，张彧，等.犬常规冷冻稀释液中添加谷胱甘肽的研究[J].北京农业，2010，4月下旬刊：1-9.

[3]Luberda Z.The role of glutathione in mammalian gametes[J].Reprod Biol，2005，5(1)：5-17.

2016-05-27

上海农林职业技术学院院内科研课题(091124)

滑志民(1979-)，男，硕士，讲师。研究方向：动物繁殖调控与胚胎工程。

E-mail：huazhimincn@163.com

S829.2

A

1005-2739(2016)05-0014-03