骨碎补总黄酮对牵张成骨过程中骨形态发生蛋白-2和转化生长因子-β1表达的影响

高怡加，黄培镇，李悦，姜自伟，杨冰，黄枫，陈基长

（1.广州中医药大学第一附属医院骨科，广东广州　510405；2.广州中医药大学第一临床医学院　广东广州　510405）

骨碎补总黄酮对牵张成骨过程中骨形态发生蛋白-2和转化生长因子-β1表达的影响

高怡加1，黄培镇1，李悦1，姜自伟1，杨冰2，黄枫1，陈基长1

（1.广州中医药大学第一附属医院骨科，广东广州510405；2.广州中医药大学第一临床医学院广东广州510405）

【目的】探讨骨碎补总黄酮对家兔股骨牵张成骨的影响。【方法】选用健康家兔32只，随机分为治疗组和对照组，每组16只。行单侧股骨牵张术，以自制延长器固定。经7 d延迟期，以1 mm/d的速度牵张，2次/d，连续10 d。治疗组动物自术后第1天用骨碎补总黄酮溶液灌胃，至实验结束。固定28 d后处死动物，留取标本，行组织学观察及免疫组织化学检测。【结果】治疗组新生骨组织成熟骨质区域增大，成骨细胞数、骨小梁面积百分比均显著高于对照组，骨形态发生蛋白-2 （BMP-2）和转化生长因子-β1（TGF-β1）呈棕色深染，染色程度显著高于对照组。【结论】骨碎补总黄酮能有效地加速骨牵张中新生骨质的生成与成熟。

牵张成骨；骨碎补总黄酮；BMP-2；TGF-β1

目前，牵张成骨（distraction osteogenesis，DO）技术在临床被广泛应用于骨髓炎、骨肉瘤、各种先后天骨畸形等疾病的治疗，但存在固定时间长的弊端。寻找一种有效、安全的方法，缩短牵张成骨固定时间，一直是骨科工作者努力的方向。近年来，对内源性骨生长因子在牵张成骨过程中的表达和意义，以及将外源性骨生长因子植入促进牵张延长过程中新骨形成成为研究热点。研究虽取得了一定成绩，但离应用于临床尚有很大差距，甚至可能存在抑制成骨的反作用。祖国医学在促进新骨形成、骨折愈合方面积累了大量经验。研究表明，骨碎补总黄酮可加速成骨细胞分化和增殖，促进骨基质形成和钙盐沉积，提高骨修复中骨质形成和成熟的速度［1］。本研究应用组织学、免疫组织化学等方法，初步探讨骨碎补总黄酮对家兔股骨牵张成骨新骨形成过程中骨形态发生蛋白-2（BMP-2）和转化生长因子-β1（TGF-β1）的影响，为中医中药在牵张成骨领域的应用提供实验依据，现将结果报道如下。

1　材料与方法

1.1实验动物选用清洁级健康成年新西兰兔，购自广州中医药大学实验动物中心，许可证号：SCXK（粤）2008-0002，动物质量合格证号：No. 44007200006322，32只，雌雄不限，体质量2.5～3.0 kg。

1.2实验药物骨碎补总黄酮由北京歧黄制药有限公司提供，国药准字H20030007，批号：130925，每粒胶囊0.25 g，含有效成份0.18 g。

1.3主要仪器和试剂采用自行设计的组合式单边家兔股骨牵张器。5804R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；TP1020半自动台式组织脱水机、Leica AutoStainer XL自动染色机（德国Leica biosystems公司）；KD-BM生物组织包埋机、KD-202石蜡切片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司），BX 53生物显微镜（日本Olympus公司）。兔BMP-2、TGF-β1免疫组织化学试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）。

1.4动物模型制备术前24 h禁食、水，肌注利眠宁（0.1 mL/kg）全身麻醉，常规备皮消毒，分别在股骨外侧皮肤做一长约4 cm纵行切口，显露股骨，在股骨中段截骨，在骨折远近两端各安放自制牵张器，置入克氏针牢固固定，最后逐层缝合。间歇期为7 d，后每天以1 mm/d的速率牵引，共牵引10 d，之后固定28 d。

1.5动物分组与给药将实验动物随机分为治疗组和对照组，每组16只。治疗组动物自术后第1天，根据人和动物体表面积换算，每日给予剂量0.108 g·kg-1·d-1灌胃；试验过程中每2周称体质量1次，根据体质量调整给药量。对照组用等体积生理盐水灌胃。术后3 d每天腹腔注射0.1 mL青霉素（2.4×105mg/L）。

1.6标本采集、观察与处理牵张固定完成后处死实验动物，截取股骨牵张区骨痂生长部位及其两端正常骨组织为标本，去除软组织。观察标本牵张区股骨的外观形态、牵张器固位情况和牵张区成骨情况。

1.7标本切片制作分切标本，一部分标本置于10%（体积分数，下同）的中性甲醛溶液中，另一部分置于4%多聚甲醛（含0.1%焦炭酸二乙酯）溶液中，固定24 h，然后用乙二胺四乙酸脱钙，乙醇逐级脱水，石蜡包埋，制作石蜡切片。

1.8组织学检查切片经苏木精—伊红（HE）染色，光学显微镜下放大200倍后观察骨组织学表现。

1.9免疫组织化学SP法染色与分析将切片标本用免疫组织化学SP法，检测股骨牵张区骨组织中BMP-2和TGF-β1的表达。采用Tavkli评分系统［1］对染色结果进行观察分析，对骨生长因子在牵张成骨骨痂中的表达进行半定量分析。“+++”、“++”、“+”分别代表免疫组织染色的强、中、弱，“+/-”代表不确定或极微阳性染色，“-”代表染色为阴性。

1.10统计方法采用SPSS 17.0软件进行统计分析，2组间比较采用Fisher确切概率法，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1大体标本观察图1结果显示：治疗组标本牵张间隙处骨膜厚度与正常骨膜相当，骨膜与牵张间隙内骨痂结合紧密，新生骨组织填充牵张间隙充分，具有一定的机械强度，骨断端已连接。

2.22组骨组织学表现图2结果显示：与对照组比较，治疗组骨组织形成过渡区范围扩大明显，纤维组织区明显减少或消失，软骨区少；针状骨小梁出现在少量纤维组织带内，成骨细胞沿类骨质边缘排列密集；骨质形成过渡区，新生骨小梁数目增多、宽度增大，边缘有成骨细胞密集排列，骨小梁间距减小，成骨细胞于骨小梁周围整齐排列；靠近截骨线处骨成熟区范围增加。

图1　治疗组家兔固定28 d股骨的大体形态Figure 1　Macroscopic features of rabbit femur in the treatment group after 28-day fixation

图2　2组家兔固定28 d骨组织学观察（HE染色，×200）Figure 2　Histologicfeaturesofrabbitbonetissue in the two groups after 28-day fixation（by HE staining，×200）

2.32组免疫组织化学结果从免疫组织化学S-P法染色结果可见BMP-2和TGF-β1在细胞胞浆中呈棕黄色。对这2种骨生长因子在牵张骨痂中的表达进行半定量分析后，结果显示：治疗组BMP-2、TGF-β1染色阳性率均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1、表2。

表1　2组BMP-2染色程度比较Table 1　Comparison of BMP-2 staining degrees in the two groups

表2　2组TGF-β1染色程度比较Table 2　Comparison of TGF-β1 staining degrees in the two groups

图3、图4结果显示：固定28 d后，治疗组股骨牵张区组织BMP-2和TGF-β1深染程度显著高于对照组，表明治疗组中相关目的蛋白的含量高于对照组。

图3　2组家兔固定28 d股骨牵张区组织BMP-2表达比较（免疫组织化学法，×200）Figure 3　Comparison of BMP-2 expression in rabbit femur distraction area of the two groups for 28-day fixation （by immunohistochemical method，×200）

图4　2组家兔固定28 d股骨牵张区骨组织TGF-β1表达比较（免疫组织化学法，×200）Figure 4　Comparison of TGF-β1 expression in rabbit femur distraction area of the two groups for 28-day fixation （by immunohistochemical method，×200）

3　讨论

长骨干骨缺损一直是临床治疗的难题，其形成原因主要有严重开放性粉碎骨折、骨不连、骨折术后感染、慢性骨髓炎大块死骨切除或肿瘤长段骨切除等。传统游离松质骨植骨修复后，即使覆盖的软组织血运良好，也常会有不同程度的骨吸收，对于超过4～6 cm的长段骨缺损存在较大的应用局限；带血运的骨移植虽愈合较快，但对显微技术要求过高，且存在损伤大、出血多、移植骨较细、再骨折风险高等不足，难以推广［2］。牵张成骨技术基于牵张成骨原理，配合日益发展的外支架技术，可有效治疗骨不连与骨缺损，也可矫正各种原因导致的肢体畸形。牵张成骨技术的有效应用使骨髓炎及骨肿瘤治疗中大段截骨也得到了很好的解决，治疗效果取得了飞跃式的提高。此外，对骨缺损患者而言，应用牵张成骨技术使患者避免了骨移植供区的痛苦及相关风险。所以，牵张成骨技术在骨缺损的治疗中发挥着越来越重要的作用［3］。但牵张成骨在临床上也存在一些不足之处尚待解决，如固定时间长，总的治疗时间也相应较长等。多年来，研究者们进行了大量临床和实验研究，应用多种方法加速成骨，以缩短治疗周期。

Kim等［4］发现将重组外源性生长因子BMP-2作用于兔胫骨牵开区，能起到促进成骨的作用。但是，外源性BMP-2的最佳使用剂量尚不明确，使用效果也不确切；BMP-2局部应用时容易因弥散、稀释或丢失而需反复使用，导致费用增加。何时导入外源性BMP-2、BMP-2剂量多少、处理方式如何、多种细胞因子之间的相互调控作用等，都有可能影响其生物功能，难以充分发挥其作用。另外，外源性BMP-2半衰期短，需大剂量才能刺激足量骨形成，从而容易产生毒性作用。因此，外源性生长因子的应用受到了较大的限制，未能在现实中得到有效的推广。

近年来，由于转基因技术的发展及运用，使用内源性生长因子来加速新骨形成已经成为一个新的热点。Ashinoff等［5］将腺病毒介导的BMP-2直接注射在大鼠下颌骨牵张间隙内，发现新生骨量和骨沉积均显著增加，尤以固定期的早期为甚。黄旋平等［6］研究证实BMP-2基因修饰自体骨髓间充质干细胞移植能有效促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成。提示利用转基因技术，局部基因治疗，可能具有广阔的应用前景。但目前基础研究尚未成熟，效果不确切，转基因技术的发展也受到了一定的限制。

因此，在牵张成骨理论研究及外固定器械高度发展的基础上，寻找一种有效、安全促进骨生长的方法，缩短牵张成骨的固定时间，具有非常重要的意义。祖国医学认为：肾为先天之本，肾藏精，主骨生髓；骨的生长、发育、强弱与肾精盛衰关系密切。受中医中药研究理论的启发，本课题组尝试将牵张成骨与中医中药结合起来，为牵张成骨的发展探寻一条行之有效的途径。本研究所用中药骨碎补味苦、性温，归肝、肾经，具有续伤镇痛、补肾固精、活血化瘀、止血之功效，主治肾虚脚软、跌仆损伤等症，为中医骨伤科常用药物［7］。现代药理研究表明骨碎补的主要活性物质为骨碎补总黄酮。研究［8］发现：骨碎补总黄酮对促进骨损伤的愈合有重要作用，它除了可以促进成骨细胞增殖，还能抑制破骨细胞活性，增加骨密度，改善骨质量，提高血钙浓度，抑制骨吸收。

TGF-β是一组具有多种功能的多肽，目前已发现有5种异构体形式，在人体中只存在TGF-β1、2、3三种形式，可由许多正常细胞如单核细胞、成骨细胞、成纤维细胞等产生，在血小板和骨组织中含量最为丰富。TGF-β的生物学功能十分广泛，在胚胎发育、形态发生、细胞分化、组织增生、炎症及损伤修复中都有重要作用，特别在调节细胞生长和分化方面，同时能调控细胞外基质蛋白的形成。BMP是TGF-β超家族中的一组多功能细胞因子，现已发现BMP 1～12。BMP主要由成骨细胞合成及分泌，是一种疏水酸性糖蛋白，其主要生物学作用是诱导未分化的间充质细胞分化为成软骨细胞或成骨细胞，即所谓诱导成骨作用［9］。TGF-β和BMP均为与骨代谢密切相关的蛋白，其表达水平在一定程度上能影响骨的愈合能力。

本课题组在牵张成骨理论研究的基础上，应用祖国传统医学理论，通过大量的文献分析，选用中药骨碎补总黄酮进行干预，观察中药在兔股骨牵张成骨过程中对新骨形成及BMP-2和TGF-β1表达的影响。结果显示：在固定第4周时，治疗组骨小梁形态粗大均匀，排列密集，而对照组骨小梁稀疏且粗细不均，表明骨碎补总黄酮在骨牵张区新生骨质的形成和钙化上有重要作用。通过免疫组织化学染色发现，治疗组胞浆中BMP-2和TGF-β1呈棕色深染，染色程度显著高于对照组（P＜0.05），表明骨碎补总黄酮能显著增加骨中BMP-2和TGF-β1的含量，促进成骨细胞分化、增殖，加速骨形成。BMP-2和TGF-β1二者最强表达均见于牵张刚刚结束的时候，这种表达时段上的一致性说明二者在牵张成骨的过程中可能存在某种协同作用，其机制有待进一步研究。

本研究首次将骨碎补总黄酮引入牵张成骨治疗中，结果表明其可有效加速新生骨质的生成与钙化。骨碎补总黄酮在牵张成骨中的应用研究，为缩短牵张成骨的固定时间提供了一种新的治疗思路，进一步促进了骨缺损和骨延长治疗的开展。

［1］孙丙银.骨碎补总黄酮促进股骨缺损牵张成骨新骨形成的实验研究［D］.广州：广州中医药大学，2013：43-44.

［2］Ashman O，Phillips A M.Treatment of non-unions with bone defects：which option and why［J］.Injury，2013，44（Suppl 1）：S43.

［3］Papakostidis C，Bhandari M，Giannoudis P V.Distraction osteogenesis in the treatment of long bone defects of the lower limbs： effectiveness， complicationsandclinicalresults； a systematic review and meta-analysis［J］.Bone Joint J，2013，95-B（12）：1673.

［4］Kim I S，Park J W，Kwon I C，et al.Role of BMP，betaig-h3，and chitosan in early bony in distraction osteogenesis in a dog model［J］.Plast Reconstr Surg，2002，109（6）：1966.

［5］Ashinoff R L，Cetrulo C L Jr，Galiano R D，et al.Bone morphogentic protein-2 gene therapy for mandibular distraction osteogenesis［J］.Ann Plast Surg，2004，52（6）：585.

［6］黄旋平，周诺，江献芳，等.人骨形态发生蛋白2基因修饰自体骨髓间充质干细胞移植促进兔下颌骨牵张成骨实验的组织形态学观察［J］.中国组织工程研究，2012，16（23）：4242.

［7］闫宝勇，董福生，董玉英，等.补肾壮骨中药对成骨质量和骨钙蛋白的影响［J］.国际口腔医学杂志，2011（2）：159.

［8］彭双，韩立峰，王涛，等.骨碎补中的化学成分及药理作用研究进展［J］.天津中医药大学学报，2012（2）：122.

［9］Zhang R，Oyajobi B O，Harris S E，et al.Wnt/β-catenin signaling activates bone morphogenetic protein 2 expression in osteoblasts［J］.Bone，2013，52（1）：145.

【责任编辑：侯丽颖】

Effect of Rhizoma Drynariae Total Flavones on Expression of Bone Morphogenetic Protein 2 and Transforming Growth Factor β1 in Distraction Osteogenesis

GAO Yijia1，HUANG Peizhen1，LI Yue1，JIANG Ziwei1，YANG Bing2，HUANG Feng1，CHEN Jizhang1
（1.Dept.of Orthopedics，the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China；2.The First Clinical Medicine School，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China）

ObjectiveTo investigate the effect of total flavones of Rhizoma Drynariae on femur distraction osteogenesis in the rabbits.Methods Thirty-two healthy rabbits were randomly divided into treatment group and control group，16 rabbits in each group.The femoral fracture was treated with unilateral femoral distraction and was fixed with a self-made distraction instrument.After 7-day intermittent period，the fractured femur was distracted at a rate of 1 mm/d，twice a day for 10 continuous days.The treatment group was fed with total flavones of Rhizoma Drynariae from the first post-operative day to the end of the experiment.And then all of the animals were sacrificed after fixation for 28 days.The bone specimens were used for histological observation and immunohistochemical detection.Results The area of mature bone in the newborn bone tissue of the treatment group was increased，and osteoblasts number and the percentage of trabecular bone area were significantly higher than those of the control group.The bone morphogenetic protein-2（BMP-2）and transforming growth factor-β1（TGF-β1）were stained brown deeply，the staining degree being stronger than that of the control group.Conclusion Rhizoma Drynariae total flavones can effectively accelerate the formation andmaturation of newborn bone tissue during bone distraction.

distraction osteogenesis；Rhizoma Drynariae total flavones；BMP-2；TGF-β1

R285.5

A

1007-3213（2016）05-0679-05

10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．05．015

2016-05-04

高怡加（1979-），男，硕士研究生，主治医师；E-mail:gaoyijia99@163.com

国家自然青年科学基金资助项目（编号:81403413）；广东省中医药局建设中医药强省科研项目（编号:20131164）