云南不同地区非小细胞肺癌EGFR基因突变检测分析

杨长绍，徐文漭，冯　强，王媛媛，潘鑫艳，王　力，杨举伦，王　丽

云南不同地区非小细胞肺癌EGFR基因突变检测分析

杨长绍，徐文漭，冯强，王媛媛，潘鑫艳，王力，杨举伦，王丽

目的探讨云南不同地区非小细胞肺癌(NSCLC)患者的表皮因子生长受体(EGFR)基因突变情况。方法收集2012 年5月～2015年1月本院云南不同地区NSCLC患者手术标本250例，其中昆明86例，宣威81例，其他地区83例。运用ARMS-Taqman探针法检测标本中EGFR基因突变情况。结果昆明地区86例中，48例 (55.8%)存在EGFR基因突变，其中19Del、L858R占总突变的81.3%（39/48），有4例同时存在19Del、L858R突变；宣威地区81例中，43例(53.1%)存在EGFR基因的突变，其中19Del占总突变的14.0%（6/43），L858R占总突变的34.9%（15/43），G719X及S768I占总突变的41.9%（18/43），有4例同时存在G719X、S768I双突变；其他地区83例中，40例(48.2%)存在EGFR基因的突变，其中19Del、L858R占总突变的77.5% （31/40）。结论云南大部分地区EGFR基因突变情况与国内报道一致，主要以EGFR基因19Del及L858R突变为主；而宣威地区NSCLC患者中，EGFR基因突变主要以L858R为主，19Del的突变低于云南其他地区，S768I则明显高于云南其他地区。

非小细胞肺癌；EGFR基因；基因突变；云南

肺癌是目前常见的恶性肿瘤之一，全球每年因肺癌死亡的人数超过100万，其中NSCLC最常见，约占全部肺癌的80%～90%[1]。在我国，肺癌已成为恶性肿瘤第一死因，而云南省的肺癌发病率与死亡率一直在国内位居榜首。许多研究发现，表皮因子生长受体 （epidermal growth factor receptor,EGFR）基因突变与 EGFR络氨酸激酶抑制剂（EGFR-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）的药物治疗靶点相关，并已被研究及广泛应用于临床。但由于地区的差异性，可能导致不同地区NSCLC患者EGFR基因突变存在差异。本研究就云南不同地区NSCLC者的EGFR基因突变情况进行检测分析。

1　材料与方法

1.1标本来源收集2012年5月～2015年1月本院云南不同地区NSCLC患者手术标本250例，其中宣威地区81例，昆明地区86例，其他地区83例。所有标本均经过10%中性福尔马林固定、石蜡包埋，NSCLC病理诊断明确，每例标本均含足够肿瘤病变组织进行后续检测。

1.2样本DNA提取用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit试剂盒 （QIAGEN公司）提取标本块中基因组DNA，按试剂盒说明书进行操作，所提的DNA均保存于-20℃备用。

1.3ARMS-Taqman探针法检测

1.3.1加样上机从人EGFR基因突变检测试剂盒(北京雅康博生物科技有限公司)取出已预分装的八连管，在冰上融化后短暂离心，按试剂盒说明书进行操作。荧光信号收集时设定为FAM、HEX荧光信号，在60℃设置荧光信号收集。

1.3.2结果判断根据人EGFR基因突变检测试剂盒说明书，阳性、阴性对照及FAM、HEX满足要求则继续分析样品的突变情况。

1.4直接测序法从250例标本中随机选取40例标本，用直接测序法进行验证。

1.5统计学方法数据采用SPSS22软件进行统计学处理，组间基因突变风险使用相对危险度（relative risk，RR）比较，RR＜1、P≤0.05，表示该组基因突变风险偏低；RR＞1、P≤0.05，表示该组基因突变风险偏高。

2　结果

2.1云南不同地区NSCLC患者EGFR基因突变分布本组250例标本中，131例 （52.4%）EGFR基因发生突变，不同地区EGFR基因突变率在33.3%～66.7%（表1）。

表1　云南不同地区EGFR基因突变情况［n（％）］????????? ???　n 　????　???? ????　????　??????????　?????????? ???　???　?? ???????　?????????? !"?　???　??????????　?? ??????? #$?　???　??????????　??????? ?? %&?　???　??????????　?????????? ’(?　???　??????????　?????????? )*?　 ??　?? ???????　?? ???? ?? +,?　???　??????????　?????????? -.?　???　??????????　?????????? /??　???　??????????　?????????? 01?　 ??　?? ???????　?????????? 23?　???　??????????　?????????? 45?　???　??????????　??????????

表2　云南不同地区NSCLC患者EGFR基因各外显子突变比较［n（％）］?????n?????　?????????????????????? ?????　???　????????　???　???　??????　???　??? n 　???　???　???　?　?　?　?　?　? ??????　????? ???　??? !??　???!? "??　" ???　" ???　" ##?　" "#?　" $??　" "?? ?????%&???’?　!?! ???　"?" "??　"?" "??　? ???　" ?!?　" ???　" ???　$ ?"?　" !"? (???)?　??? ???　!?! ???　$?? "??　$ ?"?　" $??　" ?!?　" ?"?　? $$?　" ?#? &???’?　???$" ???????? ???　?#?#$ ???　? !#?　" #??　" ???　" ?"?　?? ???　" "$? *???+?　"?" "??　?"??$ #??　??$ ???　" #$?　" !??　$? !??　" "#?　$ ?"?　" !"? *???+%(???)?　??? $??　!?! ???　$?? "??　" !??　" ???　! !$?　" ???　" ???　" ??? ,??"-?　??? $??　$?$ ???　#?? ???　" #??　" #$?　$ ???　" ?!?　$ "??　" ??? ,??"-%&???’?　$?$ #??　$?$ ???　??$ ???　? ???　" ???　? "??　" ???　" $??　" "??

2.2云南不同地区NSCLC患者EGFR基因突变比较从表2可见，昆明地区86例中，48例(55.8%)存在EGFR基因的突变，其中19Del、L858R占总突变的81.3%（39/48）；其他地区83例中，40例(48.2%)存在EGFR基因的突变，其中19Del、L858R占总突变的77.5%（31/40），各外显子均无统计学差异。

宣威地区81例中，43例(53.1%)存在EGFR基因的突变，其中19Del占总突变的14.0%（6/43），昆明地区EGFR基因19Del占总突变的35.4%（17/48），两地区基因突变风险RR＜1，表示宣威地区EGFR基因19Del基因突变风险低于昆明地区（P=0.003）。宣威地区S768I占总突变的23.3%（10/43），昆明地区EGFR基因S768I无独立突变，宣威地区S768I基因突变风险约是昆明地区的25倍（P=0.003），存在统计学差异。其余各外显子均无统计学差异。

宣威地区与除昆明外的其他地区比较，EGFR基因19Del基因突变风险RR＜1（P＜0.05），表明宣威地区基因突变风险低于其他地区；而S768I基因突变风险 RR＞1（P＜0.05），表明宣威地区S768I基因突变风险高于其他地区（约12倍）；其余各外显子均无统计学差异。

2.3直接测序法与ARMS-Taqman探针法检测结果对比从250例标本中随机选取40例，用直接测序法进行验证，其中1例标本ARMS-Taqman探针法检测EGFR基因突变阴性（图1），用直接测序法验证该例EGFR基因20号外显子第787密码子（CAG>CAA）同义突变（图2），但未造成氨基酸改变，结果为阴性。其余标本直接测序法与ARMSTaqman探针法结果一致。

3　讨论

EGFR基因位于人第7号染色体p13～q22区域，全长约20万个碱基，共有28个外显子，分别编码胞外区、跨膜区及胞内区3个部分总共1186个氨基酸，其糖基化蛋白的分子量约为170 kDa[2-3]，胞内区具有络氨酸激酶活性，负责将胞外信号传递到胞内。异常的EGFR活化能够促进肿瘤细胞的增殖、迁移、分化、血管新生，并且能够抑制肿瘤细胞的凋亡[4]。其中EGFR基因突变主要发生在第18～21号外显子上[5]。大量研究表明[6-9]，EGFR基因18、19、21号外显子发生突变的NSCLC患者服用EGFRTKI类药物的疗效较好，因此，在选择靶向药物治疗之前进行EGFR基因突变检测尤为重要。

目前，EGFR检测的方法很多，本研究采用ARMS-Taqman探针法检测EGFR基因突变状态，并随机选取40例标本，用直接测序法进行比对，验证其结果的准确性，结果表明ARMS-Taqman探针法检测结果准确、可信。直接测序法是最直接、可检测已知和未知突变的一种方法，也是目前广泛应用的EGFR基因突变检测法[10]。但由于该方法灵敏度相对较低，对于样本量较少的标本，如穿刺、内窥镜活检小标本，可能不能敏感地检测出突变。而ARMSTaqman探针法检测灵敏度比直接测序法高，检测周期短，可以对穿刺标本及细胞学标本进行检测，且扩增时闭管操作的特点，极大程度避免了扩增产物的污染，易于在临床样品中检测开展。

在中国EGFR基因的突变存在显著的地域差异，文献报道[11-14]，台湾地区的EGFR基因的突变以外显子21为主，云南和广东地区以外显子19为主。本研究结果显示，云南大部分地区NSCLC患者中，EGFR基因的突变主要发生在19号外显子缺失及21号外显子L858R突变，与报道一致。而宣威地区NSCLC患者中，EGFR基因主要以L858R突变为主，19Del的突变低于云南其他地区，S768I则明显高于云南其他地区，与国内报道存在一定差异。昆明地区NSCLC患者EGFR 18号外显子G719X占总突变的10.4%（5/48）；宣威地区EGFR 18号外显子G719X占总突变的18.6%（8/43），其中4例同时存在S768I、G719X双突变；其他地区EGFR 18号外显子G719X占总突变10.0%（4/40），其中2例同时存在S768I、G719X双突变，比文献报道[15]EGFR 18号外显子上发生G719X点突变约占EGFR突变类型的4%高。EGFR基因第20号外显子S768I在昆明及其他地区突变率较低，而宣威地区S768I突变率达到23.3%（10/43），其中S768I、G719X双突变占9.3%（4/43），远高出报道的1%及2%[16]。

宣威地区肺癌患者EGFR基因突变与其他地区差异，究竟反映了发病机理的不同，饮食习惯，燃煤因素，还是遗传学背景的区别，值得深入细致的研究。

图1　ARMS-Taqman探针法检测EGFR基因突变

图2　直接测序法验证EGFR

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EGFR gene mutation of non-small cell lung cancer from different regions of Yunnan province

Yang Changshao,Xu Wenmang,Feng Qiang,Wang Yuanyuan,Pan Xinyan,Wang Li,Yang Julun,Wang LiDepartment of Pathology,Kunming Generalhospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan,650032,China

ObjectiveTo investigate the epidermal growth factor receptor(EGFR)gene mutation of patients with non-small cell lung cancer(NSCLC)from different regions of Yunnan.Methods250 operative specimens of patients with NSCLC who were from different areas of Yunnan andhospitalized between May 2012 and January 2015 were collected,in which there were 86 cases from Kunming city,81 ones from Xuanwei city,and 83 ones from other regions.ARMS-Taqman probe method was used to detect the EGFR gene mutation in those specimens.ResultsAmong the 86 cases from Kunming,there were 48 ones(55.8%)of EGFR gene mutation, in which 19Del or L858R accounted for 81.3%of the total mutation(39/48).19Del and L858R existed at the same time in 4 cases. Among the 81 cases from Xuanwei,there were 43 cases(53.1%)of EGFR gene mutation,in which 19Del,L858R,and G719X or S768I accounted for 14.0%(6/43),34.9%(15/43),and 41.9%(18/43),respectively.Double mutation of G719X and S768I existed in 4 cases.Among the 83 cases from other regions,there were 40 cases(48.2%)of EGFR gene mutation,in which 19Del or L858R accounted for 77.5%(31/40).ConclusionThe situation of EGFR mutation in most regions of Yunnan is the same as that reported in our country,in which 19Del and L858R are the predominant gene.Among the NSCLC patients from Xuanwei,L858R is the main gene mutation.Their proportion of 19Del is lower than that of patients from other regions of Yunnan,but the proportion of S768I is significantlyhigher than that of patients from other regions.

non-small cell lung cancers;EGFR gene;gene mutation detection;Yunnan

R 734.2

A

1004-0188（2016）01-0004-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.01.002

国家自然科学基金青年基金（81201759）；云南省应用基础研究面上项目（2012FB210）

650032昆明，成都军区昆明总医院病理科

王丽，电话：0871-64774212;E-mail：2001wl@163.com

（2015-11-17）