SDNF联合HGF对大鼠肌卫星细胞体外活性的作用

邬　江，徐永清，朱　敏，朱崇涛，陈旭升

SDNF联合HGF对大鼠肌卫星细胞体外活性的作用

邬江，徐永清，朱敏，朱崇涛，陈旭升

目的探讨许旺细胞源神经营养因子（SDNF）联合肝细胞生长因子（HGF）对鼠肌卫星细胞增殖分化的作用。方法建立大鼠肌卫星细胞体外培养体系，按培养基不同分为4组：10%胎牛血清培养基（A组）、10%胎牛血清＋400 ng/ml SDNF（B组）、10%胎牛血清＋200 ng/mlhGF（C组）和10%胎牛血清＋400 ng/ml SDNF＋200 ng/mlhGF（D组），动态观测肌卫星细胞的形态、MTT生长曲线和肌管形成率等指标的变化。结果含不同因子的培养基均可促进肌卫星细胞增殖；MTT检测结果显示，C组和D组细胞生长较为旺盛，但B、C、D组间差异尚无统计学意义（P>0.05），而A组的细胞增殖较其他3组缓慢（P<0.05）；与A组相比，其他3组细胞融合数明显增多，以B组和D组肌管形成较为突出（P<0.01）。结论HGF主要作用于肌卫星细胞的激活和增殖，而SDNF则侧重于肌卫星细胞的分化，两种因子共同作用有某种程度的叠加效果。

肌卫星细胞；许旺细胞源神经营养因子；肝细胞生长因子；增殖；分化

肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF)是目前已知的唯一可激活静息状态肌卫星细胞的细胞因子。许旺细胞源神经营养因子（Schwann cell-derived neurotrophic factor，SDNF）是近年来从许旺细胞中提取的，具有运动神经元保护和促周围神经再生的一种神经营养因子[1-2]。而肌卫星细胞作为周围神经主要靶器官——肌肉的干细胞，经证实在体外其增殖和分化与SDNF有一定的相关性。然而HGF和SDNF对肌卫星细胞生物活性的联合作用尚无相关的研究报道。为肌组织工程进一步研究的需要，为获得高产量和高成肌性的肌卫星细胞，有必要在体外评估这两种因子对肌卫星细胞活性的联合作用，为此本课题进行了相关研究。

1　材料与方法

1.1SDNF制备按本实验室标准操作程序[3]制备SDNF。

1.2细胞培养及分组细胞取自3月龄Wistar雄性大鼠[由南方医科大学动物所提供，动物合格证号：SCXK(粤)2006-0015]。具体培养、鉴定方法见参考文献[4]。细胞采用10%胎牛血清培养基原代培养，常规行α-sarcometric actin免疫细胞化学法鉴定。分组：96孔培养皿原代培养至第2 d换用无血清培养基培养24h后，细胞分别用10%胎牛血清培养基（A组）、10%胎牛血清＋400 ng/ml SDNF（B组）、10%胎牛血清＋200 ng/mlhGF(Sigma)（C组）和10%胎牛血清＋400 ng/ml SDNF＋200 ng/mlhGF（D组）条件培养基培养。培养72h后分两批处理：（1）各组每日取3孔细胞计数，取3孔行MTT法检测，记录细胞生长曲线；（2）2%胎牛血清促分化处理，观察分化时间，计数肌管形成数。

2　结果

2.1细胞形态变化A组细胞在接种培养后16～24h均已完全贴壁，且见有小突起长出，逐渐形成梭形、纺锤形，均表现出典型的肌卫星细胞形态变化特征，经台盼蓝染色，显示成活率均在95%以上；24h后，见大量折光率强的圆形细胞贴壁，且有极个别细胞有小突起；48h后，可见大量梭形、纺锤形的单核细胞出现，其间混杂少量扁平、多突起、胞浆丰富的成纤维细胞；随培养时间的延长，梭形细胞的数量逐渐增加，其胞浆出现2～3个突起，相互拉网；继续培养，单核细胞相互融合成为多核的肌管，肌管逐渐粗大、分叉增多。免疫细胞化学证实这些细胞胞浆内细丝呈α-sarcometric actin反应阳性，而成纤维细胞和平滑肌细胞均未见有阳性细丝。与A组相比，B、C、D组细胞形态上差别不大（图1、2）。

2.2不同培养基对鼠肌卫星细胞增殖能力的影响

除A组外，加入不同因子的各组细胞均于第3 d进入对数生长期，约1 w时间达生长高峰后减缓速度。MTT检测结果显示，C组和D组细胞生长较为旺盛，但B、C、D组间差异尚无统计学意义 （P> 0.05）。而A组的细胞增殖较其他3组缓慢 （P< 0.05），见表1。

2.3不同培养基对鼠肌卫星细胞分化能力的影响

各组细胞经促分化处理后，第3 d均有融合表现；而随后与A组相比，其他3组细胞融合数明显增多，以B组和D组肌管形成较为突出（P<0.01），见表1。

图1　A组鼠肌卫星细胞形态

图2　B组鼠肌卫星细胞形态

表1　培养第7d各组鼠肌卫星细胞活性比较?????????????????????????????? ??　????????????　? ?????!?"???　?? ????????? #?　??!$?????$ %?　??"???????? ??　??$ ?????"?&’?(??)*+?,??-????"./??-??????

3　讨论

3.1肌卫星细胞的调控肌卫星细胞的作用主要是补充受损的肌细胞，这也是骨骼肌受损后能部分修复的原因。肌肉受损后，受损部位周围的肌卫星细胞首先完成迁移过程，即能从健康肌纤维或肌纤维未受损端游移到肌纤维受损处。目前大量的体外研究已证实，肌卫星细胞的调控包括正性调控因子和负性调控因子两大类，而生长因子在调节肌卫星细胞激活、增殖和分化的调控中占主导地位。其中，胰岛素生长因子（IGF）类能明显提高肌卫星细胞的增殖能力和增加生肌调节因子的功能，其亚型机械生长因子（MGF）被发现有促进肌卫星细胞增殖、抑制分化的功能，成为近年来细胞研究的热点。TGF-β同时抑制细胞增殖和分化[5]。bFGF有促增殖作用，但抑制细胞分化，且bFGF较其他生长因子促增殖作用强[6]。近年有研究证实，正常成年骨骼肌中存在使肌卫星细胞激活的HGF，通过促进DNA合成、抑制细胞分化，从而形成更多的肌纤维，它是肌卫星细胞的促分裂剂和趋化剂[7]。PDGF是血清中的有丝分裂原，可以促进肌卫星细胞分化。除生长因子外，激素、基膜及成熟肌细胞亦对肌卫星细胞的生长有作用。最近又有研究表明，肌卫星细胞激活后自分泌的IL-6对其增殖有促进作用[8]。此外MRFS是肌肉形成的主要调节因子，可以使胚胎干细胞向成肌细胞方向分化，调节整个生肌程序的基因表达[9]。

3.2HGF和SDNF对肌卫星细胞的调控朱家恺课题组通过体内外试验证明，SDNF对脊髓前角运动神经细胞有营养作用，并能减轻毒物对神经细胞的损害，证实了SDNF对发育期动物运动神经元的保护作用[10]。HGF可激活静息状态的肌卫星细胞。通过本课题的研究惊奇地发现，SDNF对神经作用的靶器官之一的肌卫星细胞同样有一定的调控作用，综合本研究中肌卫星细胞的活力和生长能力的各项检测指标，发现含有HGF的两组相对单纯SDNF组可以促进肌卫星细胞增殖；但含有SDNF的两组相对单纯HGF组成肌更为突出，也就是说HGF主要作用于肌卫星细胞的激活和增殖，而SDNF则侧重于肌卫星细胞的分化，两种因子共同作用不会消弱各自的功效，相反有某种程度的叠加效果。

3.3SDNF与肌卫星细胞的作用机制SDNF是许旺细胞分泌的活性因子，正常情况下许旺细胞的神经营养蛋白mRNA的表达极低，只有当神经受损后，损伤处周围的营养蛋白表达才会增高。即使体外培养许旺细胞亦不会增加蛋白的表达[11]。本课题在进行SDNF研究时发现，该营养因子在神经损伤10 d后分泌达高峰，其机理可能是神经损伤后远端在轴突降解后产物和巨噬细胞分泌物共同刺激作用下，许旺细胞大量增生，同时许旺细胞分泌营养蛋白的量亦上调，7～14 d达高峰，持续数周（视营养蛋白的性质而定）[12]。同时在临床工作中我们也发现，在未修复损伤神经的情况下，在一定周期内，似乎中枢神经损伤者比周围神经损伤者相应支配区肌肉萎缩程度重；损伤部位离肌门越近，相应支配区肌肉萎缩程度越轻。两者的周期如此的巧合，是不是预示着神经损伤处会分泌某种或多种能延缓肌萎缩的物质？这些物质能沿着神经损伤远段进入靶器官而产生延缓肌萎缩的作用，SDNF是不是其中之一呢？本课题证实了SDNF对肌卫星细胞增殖和分化有一定的调控作用，推测该因子确实有延缓骨骼肌萎缩的作用。

总之，SDNF对肌卫星细胞增殖和分化有一定的调控作用，相对而言促分化作用更加明显。而HGF主要作用于肌卫星细胞的激活和增殖，两种因子共同作用有某种程度的叠加效果，确有延缓失神经肌萎缩的作用。

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Effects of Schwann cell-derived neurotrophic factor andhepatocyte growth factor on activity of rats'muscle satellite cells in vitro

Wu Jiang,Xu Yongqing,Zhu Min,Zhu Chongtao,Chen XushengTrauma and Orthopaedics Research Institute of PLA,Kunming Generalhospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan,650032,China

ObjectiveTo study the effects of Schwann cell-derived neurotrophic factor(SDNF)andhepatocyte growth factor on the proliferation and differentiation of rats'muscle satellite cells(MSCs)in vitro.MethodsRats'muscle satellite cell culturing systems in vitro were established and divided into four groups according to the different culture media:group A:10%FBS;group B: 10%FBS+400 ng/ml SDNF;group C:10%FBS+200 ng/mlhGF;group D:10%FBS+400 ng/ml SDNF+200 ng/mlhGF.MSCs were treated with various SDNF concentrations culture medium.The shape of MSCs was observed dynamically and cell growth curve,and the formation rate of myotube was determined.ResultsThe culturing media containing different factors all could promote the proliferation of MSCs.The MTT detection results indicated that the cell growth in group C and D was prosperous,but there was no significant difference in the growth among group B,C,and D(P>0.05).However,the cellular proliferation in group A was slower than that in the other three groups(P<0.05).The other three groups'cell fusion numbers increased significantly compared with that in group A,and the formation of myotube in group B and D was fairly obvious(P<0.01).ConclusionHGF plays major role in MSCs activation and proliferation,while SDNF can regulate the differentiation of rats'MSCs in vitro.The effects of the two kinds of factors interact and promote each other.

muscle satellite cell;Schwann cell-derived neurotrophic factor;hepatocyte growth factor;proliferation;differentiation

Q813.11/R685

A

1004-0188（2016）01-0001-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.01.001

云南省应用科学基金资助项目（2010ZC180）

650032昆明，成都军区昆明总医院全军创伤骨科研究所

1.3观测指标（1）形态变化：每天换液后，在显微镜下观察细胞生长的形态变化。（2）肌卫星细胞增殖的评价：即MTT法检测细胞生长曲线，评定增殖能力，筛选出促增殖的最佳条件培养基。（3）肌卫星细胞分化的评价：观测分化时间（肌管最早出现的小时数）和肌管形成率（即10个视野的肌管数总和与对应的细胞总数的百分比），评估分化能力，筛选出成肌效果最好的条件培养基。

1.4统计学方法应用SPSS 13.0软件进行统计学分析，各组数据比较采用方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

（2015-07-17）